L05087罗彩英

项目类别项目批准号BL05087 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称： 固定化灵芝细胞反应器生产肽多糖的研究 申 请 人： 罗彩英 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 2002级生物技术 联系电话：指导教师: 徐凤彩 高向阳 职称 教授 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 一 日 结题日期： 二六 年 四 月 一 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称固定化灵芝细胞反应器生产肽多糖的研究项目类别B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.42006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字罗彩英女1983、102002级生物技术2班生命科学学院全面研究指导教师情况姓名徐凤彩性别男学位职称教授姓名高向阳性别女学位博士职称副教授研究方向酶工程、生物制药授课名称生物化学、酶工程、生物分离技术项目简介灵芝又名灵芝仙草，万年蕈，古称瑞草，是祖国医学宝库中的一种珍贵的药用真菌。由于近代医学研究表明菌丝体细胞产肽多糖与子实体肽多糖具有相同生物活性和含量，菌丝体细胞的深层培养成为当前名贵真菌利用技术的发展热点。本项目就如何提高细胞产肽多糖的量，从细胞的固定化和深层培养条件、反应器研制等方面进行了初步研究。菌丝体细胞的固定化是通过菌丝体球与海绵的惯性碰撞作用，进而将菌丝体截留在海绵内部孔隙来实现的。选用合适孔径的海绵把细胞吸附，这既可以避免传质扩散时受到阻力，又可以避免在循环培养器中因海绵间摩擦而导致细胞脱落。固定化的灵芝细胞可在反应器中正常发酵而不随液体流走，同时，流加的等体积的培养液正常生长繁殖，从而大大提高了其产生理活性物质的效率。本项目考察了海绵量、接种量、吸附时间三个方面对灵芝菌丝体球固定化效果的影响，通过多因素正交试验优选灵芝菌丝体固定化的最佳吸附条件，并通过固液比、培养时间探索最佳发酵条件，实验证明：在250mL三角瓶100mL吸附液中，0.8g海绵载体、4mL接种量、150r/m摇瓶吸附5d所得的生物吸附量最大，在此基础上，自行研制了循环式反应器，为循环式培养灵芝菌丝体以获得最大产量的肽多糖提供依据。二、项目研究的内容与方法（一）技术路线 固定化菌丝体细胞 载体处理 固定化细胞 发酵 有效成分提取,鉴定（二）材料与方法1、材料材料：紫芝（Ganoderma Saponicum）菌丝体马铃薯、大豆载体海绵，孔径0.7mm0.9mm，0.8cm0.8cm0.8cm（长宽高）试剂与设备：试剂：葡萄糖、琼脂、蛋白胨、NaCl、KH2PO4、MgSO4、CaCO3 、苯酚、95乙醇、浓H2SO4器皿：培养皿、三角瓶、试管、玻棒、烧杯、量筒100mL 设备：电子称量器、高压蒸汽灭菌锅、沙布、棉塞、棉绳、牛皮纸、烘箱、恒温培养箱、恒温摇床培养箱、紫外分光光度计、循环式反应器2、方法培养基配制母种固体筛选纯化培养基：PDA培养基1，马铃薯（去皮）20 葡萄糖2 KH2PO4 0.075 MgSO4 0.05 蛋白胨0.5 琼脂2，pH值自然，121灭菌30min。液体种子放大培养基： 马铃薯5 + 葡萄糖2 KH2PO4 0.075 MgSO4 0.05 蛋白胨0.5 CaCO3 1，pH值自然，121灭菌30min。菌种液体吸附培养基2：马铃薯20 + 葡萄糖4 KH2PO4 0.075 MgSO4 0.05 蛋白胨1 ，pH值自然，121灭菌30min。发酵培养基：葡萄糖4 KH2PO4 0.1 MgSO4 0.05 NaCl 0.25 蛋白胨1 酵母膏 1，pH值自然，121灭菌30min。灵芝菌体球的固定及深层培养的方法A、海绵预先用蒸馏水洗净，65 烘干至恒重3，冷却至室温，将海绵块剪成0.8cm0.8cm0.8cm（长宽高），备用。B、菌种的纯化：取灵芝菌丝体细胞涂布于固体筛选纯化培养平板上，于28恒温箱培养5d，可见菌丝体长成白色绒毛状并完全覆盖固体培养基的表面。 C、菌种的液体扩大培养：将1/2平板的菌丝体打散，溶于液体扩大培养基中，置于摇床120r/min ，28恒温培养56d，见白色乳状培养基形成直径为0.2cm0.4cm的菌丝体球时即可取出，置于4保存，备用。 D、固定化方法3：称取一定量的海绵置于吸附液中一起灭菌，冷却后于无菌工作台上接入液体放大菌种，于摇床上150r/min ，28吸附培养。 E、深层培养的方法4：在无菌工作台上，将吸附有菌丝体的海绵从吸附培养基中取出，置于发酵培养基中，于摇床上150r/min ，28培养。分析方法A、 吸附效果的衡量方法：生物量的测定2、3 将吸附培养的菌丝体连同海绵虑出，65烘至恒重，减去海绵干重，即可得到菌丝体的干重。B、 发酵效果得衡量方法：胞外多糖得提取与测定5、6、7、8取2mL发酵液，加入6mL 95乙醇，4醇析过夜，然后3000r/min 离心8min，去上清，加入4mL95乙醇洗沉淀，3000r/min离心5min，去上清，重复洗一次，将沉淀溶解并定容至10mL，过滤，取滤液。以苯酚-H2SO4法测多糖含量,并用葡萄糖为标准糖做标准曲线。三、项目研究过程与资料查阅情况(一)、研究内容1、紫芝菌丝体吸附的条件研究海绵吸附法9在海绵固定化方法的基础上，通过改变某种条件，研究载体用量、接种量、吸附天数对菌丝体吸附情况的影响，从而为正交实验条件的选取提供依据。此实验过程的培养基都应在150r/min、28的恒温摇床培养箱中培养，装液量均为100mL（250mL三角瓶）。 单因素实验： 海绵载体用量对吸附效果的影响（海绵用量为A） 在确定吸附时间为5d，接种量为4mL液体菌丝体球种子不变的条件下，比较不同海绵量:0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g对吸附效果的影响，以选择最佳接种量范围（表1、图1）。 表1海绵载体用量对吸附效果的影响吸附用海绵量（g）0.60.70.80.91.0吸附菌丝体重量（g）0.4520.4930.6230.590.51 从表1、图1中可见，当海绵用量为0.8g时，吸附量最大，达到0.623g。接种量对吸附效果的影响（接种量为B） 由上述实验可知，确定海绵最适用量，设吸附时间为5d，接种量分别取：2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，并测定其吸附菌丝体的量（表 2、图2），以确定其最佳接种量。 表2接种量对吸附效果的影响接种量（mL）23456吸附菌丝体重量（g）0.5870.6110.7110.6050.569 从表2、图2中可见，当接种量为4mL时，吸附量最高，达到0.711g。吸附天数对吸附效果的影响（吸附天数为C） 在上述实验确定的海绵用量和接种量的前提下，选择吸附天数分别为：3、 4、5、6、7d ，并测定发酵液中肽多糖含量（表3、图3），以确定最佳装液量。 表3 吸附天数对吸附效果的影响吸附天数（天）34567吸附菌丝体重量（g）0.2130.4240.7110.7060.688从表3、图3中可见，当吸附天数为5d时，吸附量最高，达到0.711g。根据单因素实验得出的三个最佳吸附条件，进行正交实验：表4 固液比、接种量、吸附时间对菌丝体固定化效果影响正交表实验处理海绵量A/g接种量B/mL吸附时间C/d吸附有菌丝体的海绵重量g菌丝体的重量gA1B1C10.7351.2450.545A1B2C20.745.51.1940.494A1B3C30.7561.2590.559A2B2C30.8461.3780.578A2B3C10.8551.3590.559A2B1C20.835.51.312 0.512A3B1C30.955.51.3860.486A3B2C10.9361.2750.375A3B2C10.9451.3590.459K10.5330.4770.521K20.5500.5100.497K30.4400.5350.504R0.110.0580.024 从表4可见，三因素最佳组合为A2B3C1。 2、固定化灵芝菌丝体发酵条件的研究将用上述最佳吸附方法固定化细胞的海绵从吸附培养基中取出（注意是无菌操作），移至发酵培养基中，进行最佳发酵条件的探索。在发酵培养基的基础上，通过改变某种条件，研究时间、装液量对固定化细胞发酵产肽多糖的影响。此实验过程的培养基都应在150r/min,28的恒温摇床培养箱中进行。发酵时间对固定化细胞产肽多糖的影响 装液量为100mL，发酵时间分别取：72h、96h、120h、144h ，并测定其发酵液中肽多糖含量，以确定其最佳产糖时间段（表5、图4）。装液量对固定化细胞产肽多糖的影响 选择装液量分别取：75mL、100mL、125mL，并测定发酵液中肽多糖含量，以确定最佳装液量（表5、图4）。 表5 发酵时间和装液量对产肽多糖的影响(mg/mL)时间体积72h96h120h144h75mL10.6812.23013.03012.665100mL10.5512.09513.41514.005125mL11.7111.95213.14714.303 从表5、图4中可见，各种因素综合考虑，装液量为100mL、发酵时间120h时活性物质的得率最高，为13.415mg/mL。3、循环流反应器的研制采用通过上述正交实验最佳吸附条件制得的固定有菌丝体的海绵，依据最适的发酵条件进行循环流反应器研制（图6），同时，根据实际情况，进行条件优化，结果如表6、图5。表6 循环式反应器肽多糖含量变化（3.2g海绵载体、500mL发酵液）时间（h)A490nm多糖含量（mg/mL）00.4398.289200.58111.027300.62911.952540.63011.971780.61111.6051020.61411.6531240.63312.034从表6、图5中可见，反应54h发酵液中多糖含量最高，达到11.971mg/mL，因此，说明该循环流反应器是可行的，比摇瓶发酵缩短了66h。 7 图6 循环流反应器设计图示1、 底物瓶（液体培养液） 2、恒温水浴装置 3、恒流泵4、反应柱 5、产物收集瓶 6、灵芝菌丝细胞 7、夹子 (二)资料查阅情况1潘继红，曹霞，李峰，左正宏等。灵芝液体培养营养需求的探讨，食用菌学报，1997，4 （1）：31342 宋景平，胡志刚.灵芝液体发酵培养条件的研究，景德镇高专学报，2000，6，15（2）：35373孙亦阳.姬松茸的海绵固定化培养研究，广州食品工业科技，2004，82（4）；28294罗立新，姚汝华，周少奇.灵芝深层培养工艺的研究，华南理工大学学报（自然科学版），1997，25（5）：67705杨革.灵芝菌丝体深层培养及多糖提取工艺研究，896臧晋，黄开勋.液体深层培养中灵芝多糖的提取和纯化，食品与发酵工业，2004。30（4）：1351377 武梅，周应揆，赵永昌，李亚辉.灵芝菌丝体液体发酵培养产灵芝多糖的动态研究，云南大学学报（自然科学报），1999，21（2）：1651668罗立新，姚汝华.灵芝多糖生产工艺的研究，食用工业科技，1996，6：61629贺红，肖省娥，徐新春，徐鸿华.灵芝菌丝体深层培养的研究，广州中医药大学学报，1998，15：217219张翼伸.多糖的结构与功能，生物学通报，1992，1：34 邢小黑，孔小龙.香菇的海绵固定化培养研究，食用菌，2002（1），89四、项目成果完成形式和价值1、 确定最佳吸附条件和发酵条件的数据：最佳吸附条件：250mL三角瓶中，吸附培养液为100mL时，海绵用量为0.8g，液体菌种的接种量为4mL，150r/m摇床吸附时间为5d。经固定化后，将吸附有菌丝体的海绵移至发酵培养液中进行发酵，并通过固液比、培养时间探索最佳发酵条件，实验表明：100mL发酵液（250mL三角瓶）150/d摇瓶120h所获得的肽多糖总量最大。 2、 用可循环再用的海绵作为固定化载体，原料来源广阔，成本小，收益大，固定化效率高，而且对环境不造成污染；3、自行研制了循环式反应器，通过循环流反应器，将实验成果直接应用于实际生产。实验证明：3.2g海绵载体、500mL发酵培养液中，反应54h发酵液中多糖含量最高，达到11.971mg/mL，因此，说明该循环流反应器是可行的，比摇瓶发酵缩短了66h。 五、经费使用情况实验材料费：1000元试剂费：200元检测费：100元其它（易耗品等）：200元共计：1500元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结 该项目研究