液相色谱(NXPowerLite)

色谱分析之：,液相色谱,沈晓芳,高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。,一、概述Generalization,液相色谱仪,(一)、HPLC与经典LC区别,(二)、HPLC与GC异同点,近来出现的蒸发激光光散射检测器（ELSD）是灵敏度较高的通用检测器,流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性,操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,流程及主要部件,三、高效液相色谱法的特点和应用,特点：“三高”“一快”“一广”高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g)高选择性分析速度快(1h)应用范围广泛（可分析80%有机化合物）（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）,1按固定相的聚集状态可分为：液液色谱法(LLC)液固色谱法(LSC),2按分离机制可分为：分配色谱法吸附色谱法化学键合相色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法亲和色谱法,高效液相色谱的分类,四、流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC,1.流程,2.主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,选择高效液相中溶剂的示意图,一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation,影响分离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，根据VanDeemter方程，板高H：u为流动相线速度；A分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数；C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2.流速,流速大于0.5cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。,3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,速率方程可简化为：,Dm、Ds试样分子在流动相、固定液中的扩散系数关键是将H变小，而H变小关键是使为填料粒径dp变小，固定液液膜厚度df变小。因此采用35m固定相颗粒，且键合相层薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R大改进，实现了高效。在分离良好的基础上，才可提高流动相线速，节省了分析时间，从而实现了高速分离。,如何实现高速分离？,影响色谱峰扩展的因素,二、分离类型选择choiceofseparationtypes,理想的HPLC检测器应具有如下特性：第一，具有高灵敏度；第二，对样品所有组分都有响应，适用范围广；第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响；第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱；第五，死体积小，不造成柱外谱带扩展；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽；第八，不破坏样品组分；第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息；第十，响应时间快。,5液相色谱检测器,检测器的分类：,紫外检测器特点：应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm10mm，容积8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,B.光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,示差折光效应,示差折光检测器,DifferentialRefractiveIndexDetector,c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,优点：通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；缺点：灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；分类：偏转式、反射式和干涉型三种；,示差折光检测器,荧光检测器,荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；,荧光：从激发态分子衰变为自旋多重度相同的基态或低激发态时的自发发射现象。,荧光检测器,荧光检测器特点：（fluorescencedetector）,高灵敏度；高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；缺点：应用范围有限,电化学检测器,安培检测器：随着化合物被氧化或还原，产生正比于浓度的电流,电导检测器,ConductivityDetector,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径2050mm，柱长50cm。半制备柱（内径8mm，长度1530cm），一次制备量.1mg；,四、制备型液相色谱preparativeliquidchromatography,1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2.液相制备色谱的方法,收集组分时：（1）主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,一、超临界流体色谱的特点与原理featureandprincipleofSFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structureandgeneralprocessofSFC三、超临界流体色谱的应用applicationofSFC,五超临界色谱,Supercriticalfluidchromatograph,SFC,一、超临界流体色谱的特点与原理Principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography,1.概述超临界流体：温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(Supercriticalfluid)。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SCF)具有液相、气相色谱不具有的优点:,（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。,2.超临界流体性质,（1）性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。(3)超临界流体的密度与压力有关。,3.超临界色谱原理,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；,压力效应：,SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小;压力效应：压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.09.0106Pa，则：C16H34的保留时间25min5min。,程序升压,HPLC与SFC比较,二、超临界流体色谱的结构与流程instrumentstructureandthegeneralprocessofSFC,1.结构流程,2.主要部件,（1）SFC的高压泵无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；,主要部件,（3）流动相SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4）检测器可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器,液相色谱实用技术,色谱柱的使用及保养,色谱柱的保养（一）,样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用,色谱柱的保养（二）,流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例,在线的保护装置,给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱,在线过滤器,In-LineFilter防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）,保护柱,可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大预装保护柱有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,色谱柱的存放,存放前的处理除去杂质、盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度,色谱柱常见毛病,柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低,柱压过高,为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长,柱效低,为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯,重复性差、回收率低,实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附,色谱柱以外的因素（一）,“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大,色谱柱以外的因素（二）,柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误?,色谱柱以外的因素（三）,实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足,简单的判别方法,高的柱反压是否伴随着保留时间变化?峰形变坏?分辨率变坏?测量色谱系统的谱带展宽典型的分析系统应远小于100微升如大于此数应检查仪器系统,流动相及样品的预处理,液相色谱实用技术（二）,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例样品预