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文档简介

PCR反应原理及其操作,1.PCR的基本原理2.PCR反应体系3.PCR的基本步骤,2,PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,3,PCR反应体系,4种dNTP混合物各200umol/L（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L,4,PCR的基本步骤,1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（复性）（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,5,6,7,高温变性,8,低温退火,9,中温延伸,10,11,12,在引物作用下，Taq酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。,13,PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。,14,理论扩增率：2n递增（n为循环次数），2530循环，目标DNA可增加109倍。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式
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