代谢工程课件

第一节微生物工程菌的构建及应用,微生物工程菌的构建,基因工程在生产生物小分子中的应用,第七章基因工程,CompanyLogo,1.微生物工程菌的构建,目的基因,表达载体的构建与筛选,基因重组,转化、筛选和鉴定,鸟枪法分离基因基因文库的建立和基因分离基因的化学合成PCR或RT-PCR,通过表达载体导入外源基因不带间隔序列利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件连接后形成正确的开放阅读框架利用宿主菌的调控系统非融合型pBV220融合型pGEX系统分泌型pin系统,DNA连接方式：粘性末端平末端人工接头同聚物加尾影响连接的因素：连接酶的量作用温度与时间底物浓度,重组基因导入宿主细胞：氯化钙转化法和电穿孔法转化子的筛选与鉴定：抗药性；a-互补；限制性内切酶酶切图谱；PCR法；核苷酸序列测定等,2.基因工程在生产生物小分子中的应用,维生素、氨基酸,维生素C、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸,抗生素,头孢菌素C、新霉素、卡那霉素、阿维菌素、,第二节、抗生素合成基因的克隆（菌株未测序，基因功能不清）链霉菌的基因组大约8106bp。第一次成功地利用链霉菌的载体宿主系统克隆到抗生素生物合成基因以来，现已成功克隆到至少50个抗生素生物合成基因。发现：抗生素的生物合成基因成簇，抗性基因通常是基因簇的一部分；一些相关生物合成途径的基因相互杂交，显示出很强的同源性,优：不需要了解抗生素生物合成途径的遗传信息。,1、将目的基因克隆到标准宿主菌中，然后检测个别基因产物,抗生素生物合成途径通常涉及到1030个酶反应骤，如果通过诱变方法使其中的一个酶失活，而使其不能合成最终产物，这种突变株称为阻断突变株。成功条件：获得抗生素生物合成途径被阻断的一系列突变株。建立以阻断突变株为宿主的载体宿主系统。,2、克隆与阻断突变株互补的基因,突变克隆技术是指外源基因借助载体进入抗生素的产生菌中，如果外源基因与抗生素产生菌的生物合成基因有同源性，就有可能与产生菌的转录单位杂交，造成该基因的转录中断而影响其表达，以此确定克隆基因的性质。,3、利用突变克隆分析生物合成基因族,对已经克隆到的生物合成基因研究表明，生物合成基因成簇并与抗性基因连锁，为人们提供了这样一种设想：即用敏感菌株（标准菌或产生菌突变株）为宿主，克隆抗性基因大片段分析与之连锁的生物合成基因小片段可利用它为探针来克隆同源的DNA片段。,4、克隆抗性基因并分析连锁的生物合成基因,CompanyLogo,克隆土霉素的抗性基因（OTCr）：将土霉素产生菌StreptomgcesrimoscesM15883染色体DNA的PstI和BgIII片段分别克隆到载体质粒pRF212和pRF234的PstI和BgIII位点，转化OTCS突变株，筛选后获得了2个OTCr基因（OtrA,OtrB）,以这两个OTCr基因为探针去检测基因库，分别获得了一个阳性菌落，从中分离的DNA片段能与几个土霉素阻断突变株互补。该法克隆到的生物合成基因还包括红霉素，二丙胺磷，嘌呤霉素等。,由于链霉菌DNA中G+C的比例很高，因此链霉菌基因对密码子利用有明显的不随机性，即密码子第三位有90%以上常为G和C。因此在分析某一抗生素生物合成酶的部分氨基酸顺序后，就能设计出较低程度兼并性的寡核苷酸顺序，经人工合成这段顺序后就可用作探针从基因库中钓出所需的克隆子。,5、用人工合成的寡核苷酸探测基因库,完整的放线紫红素生物合成基因克隆到一个非产生菌小小链霉菌，结果小小链霉菌产生了放线紫红素。红霉素，土霉素的生物合成基因也用此法克隆成功。,6、直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非产生菌中,如用此策略克隆了milbemycin的生物合成基因。首先用act基因为探针与milbemycin和榴菌素产生菌的基因文库杂交，获得了actIII的同源基因，将这些来自milbemycin和榴菌素产生菌的同源DNA片段转入天蓝色链霉菌的actIII突变株，产生了类似或同样的放线紫红素色素。,七、利用已克隆的生物合成基因为探针克隆同源基因,CompanyLogo,1、解除限速步骤，提高抗生素产量控制这种限速步骤的酶基因克隆出来，然后通过合适的载体克隆到原产生菌中，获得限速步骤酶水平的增加而提高产量。生物合成头霉素C的研究过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸转向次级代谢中间产物，即头霉素C的前体-氨基己二酸的流通量的赖氨酸-氨基转移酶的活力，则必定能提高-氨基己二酸合成前体的流通量。基于以上设想，摇瓶中的抗生素产量为受体株的5倍。,第三节、利用基因工程技术改良微生物药物生产菌种,CompanyLogo,结合诱变育种，原生质体融合和基因工程技术对已知抗生素产生菌的遗传操作，以提高有效组份的含量，抑制无效成份的产生，一个最成功的例子是抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建。,2、阻断支路代谢，增加有效组份含量,七十年代末在专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb）。对VHb的功能研究表明，它作为一个氧气携带者，能促进氧气扩散到细胞未端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。人们试图从中克隆血红蛋白基因Vgb并研究它对其它微生物生长的影响。研究Vgb基因的导入对重组蛋白表达量和微生物发酵代谢产物产量的影响。但通过VHb基因的克隆提高抗生素的产量目前可能仅限于那些在发酵中非常好氧而设备条件不能满足其要求的抗生素产生菌。,3、引入血红蛋白基因增加抗生素产量,抗生素的产生与菌种对自身抗生素的耐性紧密有关。因此，利用高拷贝质粒的基因量效应，增加菌种对自身抗生素的抗性，有可能增加抗生素的产量。这一方法可能对低产菌株有效，而对工业高产菌株改良意义不大。调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要作用，增加调节基因的基因量也能大幅度提高抗生素产量。,4、引入抗性基因和调节基因，提高抗生素产量,一、代谢工程的产生及沿革二、代谢工程的理论基础三、代谢工程的研究概要四、代谢工程的研究技术与工具五、代谢工程的研究策略六、代谢工程的重要应用和发展前景,第八章代谢工程,ThefunctionofBacillussubtilisglnAgeneinEscherichiacoli,Fig.1Resultsofrecombinantstraintransformedproducts(3hand7h)andtheenzymetransformedproducts(15minand30min),基因工程的局限,Fig.2Capillaryelectrophoresisresultsofstandardsampleandthetestample,Fig.31Hnuclearmagneticresonancespectrumofthetransformedproduct.,Fig.4glnAgeneexpressioninthestraincontainingglnAwas238foldshigherthanthatofthestrainwithemptypMD19plasmid.,Fig.5.SDS-PAGEoftheproteinexpressionintherecombinantstrainsM.Marker;1.E.coliDH5;2.E.coliDH5(pMD19-glnA);3E.coliDH5(pMD19),一、代谢工程的产生及沿革,1半个多世纪微生物生理与育种知识的累积2基因工程理论和技术的成熟3代谢流定量分析技术的发展4生化工程在线检测和建模方法的发展,代谢控制发酵,代谢流定量分析技术,基因工程理论和技术,生化工程在线检测和建模方法,代谢工程基础,微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展，使得人类可以用代谢途径操作的手段来改造微生物以获得期望的性质，如在氨基酸（谷氨酸）、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到采用这个路子实现人类理想的一些突出的例子。代谢控制发酵和育种得以出现和发展。,1微生物生理与育种知识的指导半个多世纪微生物生理与育种知识的累积,这些方法主要依赖于用化学诱变剂处理微生物，并用进行设计的筛选技术来检出已获得优良性状的突变株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但人们对突变株的遗传和代谢性状的精确变化，知之甚少。,但我们已能根据随机诱变后从突变株中筛得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制的机制。,这是一种“逆行的代谢工程”（reversemetabolicengineering）。“逆行的代谢工程”为代谢网络的构建和完善，以及代谢工程的进展提供了大量的生理学和遗传学信息。,2020/5/30,29,。DNA重组的分子生物学技术的开发和应用，把代谢操作引进了一个新的层面，能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。,2基因工程理论和技术的成熟,代谢流量分析（metabolicfluxanalysis）是一种研究胞内代谢的方法，根据已有的代谢网络的信息建立胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡，以实际测得的分泌到胞外的代谢中间产物的浓度，来推算代谢流量。,3代谢流量分析技术的发展,这种分析方法的基础是拟稳态假设，即假设在产物形成速率最大的阶段各种代谢中间物的胞内浓度变化速率为零。根据质量平衡，由n个中间代谢物即可得到n个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的浓度，计算未知途径的流量。,3代谢流定量分析技术的发展,色谱、质谱、红外等在线检测手段，以及生物传感技术的发展，可为发酵在线检测和反馈提供可靠的原始数据。建模方法也有发展。,4生化工程在线检测和建模方法的发展,代谢工程重要事件纪录,二、代谢工程的理论基础,（一）基本概念（二）代谢工程要解决的问题（三）代谢工程的研究对象、目标与依据（四）代谢工程的实质（五）代谢工程理论涉及的内容,每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接使用的能量（如ATP，GTP和储存在膜上的质子运动势P），暂且把它们称为代谢能。在代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其高度有序的状态。,（一）基本概念1.微生物细胞能为其自身提供代谢能,能量转换机构,细胞质膜线粒体内膜,电子传递链和ATP酶,载体系统,跨膜的质子回路,能量产生,NADH，FADH2,一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。,2.生化反应途径和代谢途径,生化反应途径并不是孤立的，而是按生物化学规律汇成生化反应网络；代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。,3.生化反应网络和代谢网络,代谢中间化合物都在代谢网络上，有些外源有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”（把指定的化合物连接到代谢网络上去）。“联网”可以用化学或生物学方法（含DNA重组技术）来实现。已在“网”上或者可以“联网”的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。,3.代谢网络的联网问题,代谢物在代谢网络中流动形成代谢流。广义的代谢流还包括能量流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。,4.代谢流和碳架物质流,在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。,5.代谢主流,有代谢物流通过的代谢途径即载流途径。在工业发酵的目的产物生产阶段，碳架物质从原料到目的产物流经的各段代谢途径（即载流途径），按流经的先后次序首尾衔接，组合成载流路径。代谢工程需重点研究载流路径上的代谢主流。,6.载流途径与载流路径,微生物的代谢主流的方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的选择性。选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。,7.代谢主流的变动性和选择性,为了提高产物对原料的转化率，就要求代谢主流（根据代谢分析的结果）经设定的载流路径流到目的产物。这是理想载流路径。,8.理想载流路径,微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）叫做节点（node），微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在制订育种方案时必须认真考虑节点刚性问题，尽量采用解除调节的育种手段。,9.代谢网络的节点及其刚性,微生物活细胞是个远离平衡状态的开放体系，是一种靠消耗能量而维持低熵的稳定动态的特殊结构耗散结构。,10.微生物活细胞及其经济性,按经济规律运行的有利于生存竞争（生存保障）的新陈代谢特性叫做细胞经济性。细胞的经济性可以以生成细胞的重量与消耗基质的重量之比值细胞经济系数来衡量。,10.微生物活细胞及其经济性,微生物在生存竞争中进化的方向是发展其自身的适应能力和提高细胞运行的经济系数。经生存竞争而幸存下来的野生型微生物在其所栖身的环境中是富有竞争能力的，并且它们的代谢中间物在代谢网络中的分布及细胞经济运行状况有利于细胞生长、繁殖和在竞争中获胜。在上述条件下，细胞处于正常代谢状态，细胞经济体系呈现竞争型细胞经济的特色。,11.正常代谢和竞争型细胞经济,如果工业生产要求微生物在胞外累积某种代谢中间产物，则须对微生物的代谢流进行导向。根据已获得的代谢分析的信息，应用“五字策略”有可能设计理想载流途径和配套的发酵培养工艺路线和工艺条件，进而改造菌种、调整工艺，将代谢主流导向理想载流途径。在导向成功的情况下，细胞处于异常代谢状态，细胞经济体系呈现导向型细胞经济的特色。,12.异常代谢和导向型细胞经济,工业发酵依靠细胞的代谢来获得产品，导向型细胞经济固然有利于特定的代谢产物的生产，但竞争型细胞经济向导向型细胞经济的转化受到能量代谢、还原力的平衡等条件的严格制约（以保证有熵的输出），表现出代谢网络的刚性。若细胞经济实体的运行状态过度偏离竞争型运行状态，活细胞的高度有序状态将走向无序，最终导致细胞经济的崩溃。（这种刚性改变空间极有限）,13.细胞经济受到严格的制约,1必须解决理想载流途径的设计问题和对代谢主流的合理导向问题。2能量供给与平衡,14.微生物生物工程的难题,统筹全局，在“载流路径”、“代谢主流”等概念的基础上，用于设计育种以及发酵工艺控制的五字策略：“进、通、节、堵、出”。,15.代谢工业发酵的五字策略,进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；出，促进目的产物向胞外空间分泌。,在工业发酵生产中，可以把微生物细胞看作是细胞机器，它们进行能量代谢和物质代谢，背后又有一个信息处理器，它们复制和传递自己的生物信息，接收细胞内外的物理、化学甚至生物信息，并在对内外信息流进行综合处理的基础上，发出代谢调控的指令，在网络刚性的范围之内控制微生物细胞自身的生命活动。,16.信息流指导下的工业发酵,设计育种的计划不能完全兑现的原因：1违背独立自主生活的基本原则，如能量代谢2造成代谢紊乱3信息传递受阻4微生物对环境的适应性(背景不完全了解),17.限制性遗传信息之谜,微生物生物工程（现代发酵工程）基本理论在对代谢流及其控制做出了定性或半定量的分析，并在此基础上建立了工业发酵的策略思想。这就为代谢流（及其控制）的定量分析架起了桥梁。基因工程原理和已走向成熟的分子生物学技术又为我们提供了进行精确而有效的遗传修饰的手段。于是，代谢工程水到渠成了。,19.从发酵工程到代谢工程,把量化代谢流及其控制的工程分析方法与根据分析结果制定的遗传修饰方案付之实施的分子生物学技术结合起来，以反复分析、校验和修正的方式进行实际操作，改善微生物的产物形成的能力和微生物的细胞性能，从而满足人类对生物的特定需求的生物工程的分支。,22.代谢工程（定义）,（二）代谢工程的研究对象、目标与依据,研究对象：代谢网络；目标：修饰代谢过程将代谢物质流导入目的代谢产物的载流途径，以获得产物的最大转化率；主要依据：对代谢节点的判断。,（三）代谢工程理论涉及的内容,涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理；依据生物体基本的代谢图谱和生化反应的分子机理。涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理；这是代谢途径修饰的理论依据。,涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、变构抑制效应、修饰激活效应等。涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理；,（三）代谢工程理论涉及的内容,（三）代谢工程理论涉及的内容,涉及细胞生理状态平衡的细胞生物学原理。表征细胞代谢速率和生理状态。涉及发酵或细胞培养的工艺和流程控制的生化工程和化学工程的原理。涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理。,代谢工程与所有传统的工程领域一样，代谢工程也包含“分析”和“综合”两个规定的步骤。,三、代谢工程的研究概要,三、代谢工程的研究概要,但是，因为代谢工程借助于DNA重组技术而作为一种实用技术出现，所以一开始人们就把注意力放在这个领域的综合方面：新的基因在不同寄主中的表达，胞内酶的扩增，基因的删除，酶活力修饰，转录的解调或酶的解调等。,三、代谢工程的研究概要,代谢工程的一个基本目标是阐明代谢流控制的因素和机制，而系统研究代谢流及其控制机制有三大基本步骤：第一，建立一种尽可能多的观察途径并测定其流量的方法；第二，在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统达到新的稳态时的代谢途径；第三，系统分析代谢流的结果。,四、代谢工程的研究技术与工具,代谢工程的多学科性质决定了它的发展优势，同时也暗示了它在研究方法和技术方面的综合性，主要可归为三类：第一，检测技术。第二，分析技术。第三，操作技术。,检测技术,常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如同位素示踪确定代谢流的物料平衡；还有表征酶反应进程的酶动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量的质谱及光谱学方法，如核磁共振。根据这些测量信息可以判断和描述体内代谢流的基本状态，并为细胞代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。,分析技术在获得大量生化反应基本数据基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法，并结和计算机技术可以进一步阐明细胞代谢途径和代谢网络的动态特征与控制机理，同时确定途径改造的关键靶点。这些手段包括测定细胞内代谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂网络分析的组合法，即时生化反应甚至基因表达调控定量化的计量法等。,操作技术代谢工程中，代谢途径和代谢网络的操作实质上可以归纳为基因水平上的操作。如基因和基因簇的克隆、表达、调控；DNA的杂交检测与序列分析等。,四、代谢工程的研究技术与工具,研究工具分子生物学工具：几乎所有基因工程工具和技术都是代谢工程所必需的；分析化学和测量工具：经典研究代谢途径的技术，如质量平衡、阻断突变株分析等是必需的，无损伤即时分析（核磁共振）、流式细胞计量等越来越重要；,研究工具数学和计算机工具：现有的数学和计算机工具大部分都与代谢工程的信息控制和系统分析有关，代谢工程需要微生物遗传和生理信息，DNA数据库和计算机分析程序现已可获得。,四、代谢工程的研究技术与工具,五、代谢工程的研究策略,目前，代谢工程战略思想主要有以下几方面：（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流；（二）在现存途径中改变物质流的性质；（三）利用已有途经构建新的代谢旁路。,（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流,1增加代谢途径中限速步骤酶编码基因的拷贝数；2改造以启动子为主的关键基因的表达系统，强化其表达；3提高目标途径激活因子的合成速率；4灭活目标途径抑制因子的编码基因；5阻断与目标途径相竞争的代谢途径。,（二）在现存途径中改变物质流的性质,1利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性，投入原有初始底物（如类似结构物）参与代谢转化反应，进而合成细胞内原本不存在的化合物；2在酶对底物专一性较强的情况下，通过蛋白质工程技术修饰酶分子的结构域或功能域，以扩大酶对底物的识别和催化范围。,（三）利用已有途经构建新的代谢旁路,1修补完善细胞内部分途径，以利用新的底物或合成新的产物。2转移多步途径以构建杂和代谢网络。将编码某一完整生物合成途径的基因转移到受体细胞中，可以构建具有很大经济价值的生产菌株。,六、代谢工程的重要应用和发展前景,（一）代谢工程的主要应用领域：1提高细胞已有的化学物质产量（见表6-1）；2产生宿主细胞本身不能合成的新物质（见表6-2）；3扩展细胞的底物使用范围（见表6-3）；4形成降解毒性物质的新催化活性（见表6-4）；,表6-1提高细胞已有的化学物质产量,表6-2产生宿主细胞本身不能合成的新物质,表6-3扩展细胞的底物使用范围,表6-4形成降解毒性物质的新催化活性,（二）代谢工程面临的难题和发展展望,面临的难题：怎样才能保证期望活性的出现；合适的载体与基因导入方法的选择，及在代谢和信号传递途径中控制流量和流量分配机制的研究深度不够，在一定程度上限制了代谢工程更广泛的应用；代谢工程学目前还未形成可用来指导选择一个一定成功的有用的遗传改变的普遍原理。,（二）代谢工程面临的难题和发展展望,发展展望代谢工程可在分析和应用临床数据从而设计和评估新的治疗方法的领域发挥优势，提供服务；代谢工程可在对信号的转导途径的分析中发挥作用信号的网络特性为信号转导中信息流的代谢途径分析提供了广阔的空间；功能基因组学研究将成为代谢工程的一个新角色，代谢工程成为基因功能组学的前沿工程。,发展展望随着研究的深入，用整体系统的观念来研究细胞越来越显得重要。新的检测手段及数学、计算机方法的应用，为人们提供了设计和改造细胞的条件。代谢工程在生物技术领域的应用前景将更广阔，它的发展将为复杂的组织工程、基因治疗、直至整个生命的工程奠定了基础。生命的设计时代已经到来。,（二）代谢工程面临的难题和发展展望,七后基因组时代的代谢工程,从1995年第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组序列测定开始,短短十几年内,各种微生物全基因组测序以及重要微生物群落元基因组测序发展迅速。到目前为止,已经进行了3500多个微生物的全基因组测序计划,)。大量微生物全基因组序列的测定和功能基因组学技术的涌现，能够从整体上认识微生物代谢网络;能够从基因、RNA、蛋白、代谢物、代谢通量等多个层次系统地分析微生物代谢，极大地推动了代谢工程和微生物发酵工业的发展。,基因组代谢网络模型,微生物全基因组序列的测定以及基因功能注释工具的开发极大地促进了基因组水平代谢网络模型的构建，进而提高了分析代谢网络结构的能力。到目前为止,科学家们已经完成了大约20个微生物的代谢网络模型。这些模型有助于从系统水平上认识复杂的微生物代谢网络、预测细胞生理属性、预测遗传改变或环境扰动后细胞的代谢应答、模拟筛选出遗传改造的靶点基因。,典型系统代谢工程的策略分为以下3轮步骤:1)构建起始工程菌。通过分析局部代谢网络结构对局部代谢途径进行改造(如通过敲除竞争途径减少副产物的生产)、优化细胞生理性能(如解除产物毒性和反馈抑制效应)等。2)基因组水平系统分析和计算机模拟代谢分析。各种高通量组学分析技术的联合使用能有效地鉴定出提高细胞发酵生产能力的新靶点基因和靶点途径。3)工业水平发酵过程的优化。,高通量组学分析技术,1)比较基因组学:直接对比分析微生物基组。通过对具有特殊表型的突变菌进行全基因组测序并和野生型基因组进行比较分析,直接鉴定出突变基因(或调控因子)。,实例,Ikeda研究小组比较分析了高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变菌和野生型的基因组序列,成功鉴定出一系列和赖氨酸生产相关的突变基因。将其中3个突变基因导入野生型，获得了迄今为止生产速率最高的赖氨酸生产菌。通过这种“基因组育种(Genomebreeding)”重新构建的工程菌遗传背景清晰，没有多余的对细胞生长代谢造成负面影响的随机突变，适合更好地进一步遗传改造。,2)转录组学,利用DNA芯片对比分析细胞mRNA的技术。对具有特殊表型的突变菌和野生型菌株或对同一菌株在不同时空、不同培养条件下的转录组对比分析,可以快速鉴定出转录水平显著变化的基因,从而指导下一步遗传改造的靶点。Lee研究小组分析了生产人类胰岛素生长因子I的重组大肠杆菌在高细胞密度培养条件下的转录组，鉴定出转录水平显著下降的200个基因。对其中与氨基酸和核苷酸合成相关的2个基因进行扩增表达，大大提高了胰岛素生长因子I的生产。,3)蛋白质组学,利用2-D胶对比分析细胞蛋白质图谱的技术。Lee研究小组利用蛋白质组分析发现生产瘦素(Leptin)的重组大肠杆菌中，丝氨酸合成途径中的某些蛋白含量显著下降，这表明丝氨酸类氨基酸的供给可能受到限制。对其中的半胱氨酸合成酶基因的扩增表达有效地提高了细胞生长和瘦素的生产。,4)代谢组学,高通量定量分析细胞内代谢物的技术。核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)和气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF)的开发大大提高了分析胞内代谢物的能力。由于代谢物浓度是直接和代谢途径相关联的，因此它可以指导应该对哪些途径进行改造。Microbia公司结合转录组和代谢组分析，使土曲霉(Aspergillusterreus)生产洛伐他汀Lovastatin（降低胆固醇的药物)的能力提高了50%。,5)通量组学,分析细胞内代谢通量的技术。通量分析可以获知细胞内哪些代谢途径是有活性，活性有多高，从而更好地了解某个特定时空点上细胞的代谢情况。Nielsen研究小组对比分析了高产和低产青霉素的青霉菌(Penicilliumchrysogenum)的代谢通量，发现高产青霉素的能力和戊糖磷酸途径的高通量相关。,6)组学分析技术的整合:各种组学分析技术各有所长，将它们整合在一起能最大限度地了解细胞的代谢功能。Ikeda研究小组利用比较基因组学技术分析了高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变菌的戊糖磷酸途径相关基因，鉴定出6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的点突变使该酶对胞内代谢物的变构抑制不敏感。通量组分析表明该突变使赖氨酸生产过程中戊糖磷酸途径的通量提高了8%,从而提高了NADPH的供给。,1)进化代谢工程(Metabolicevolution):利用适应进化有效提高微生物发酵生产速率、产率和终浓度的技术。在微生物发酵过程中，底物利用过程一般产生能量(ATP)和还原力(NADH)；而很多产物的合成过程则是消耗还原力。通过遗传改造构建出初级的微生物细胞工厂，使目标产物成为唯一能够消耗还原力的代谢途径，从而使能量产生和还原力平衡相偶联。因此，通过在发酵反应器中连续传代培养微生物，筛选生长速率越来越快的突变菌，可以同步筛选出目标产物生产速率、产率和终浓度均显著提高的突变菌。,Ingram研究小组利用此技术，成功提高了大肠杆菌发酵生产乙醇、L-乳酸、D-乳酸等化合物的生产性能，效果非常显著(提高12个数量级）。,2)合理调控代谢途径表达:代谢合成途径的高效表达很多时候不仅仅只受限于某个单一的限速反应步骤，而是需要多个酶的协同平衡。以前经常使用