HPLC指纹图谱建立的技术要求

.,第四节HPLC指纹图谱建立的关键技术要求一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定）应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。供试品的取样参照中华人民共和国药典2010年版中规定的中药材取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。二、供试品制备必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组分应分别提取制备。三、参照物的制备选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。,.,四、测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。注意方法学考察。1、指纹图谱第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。2、共有指纹峰的标定采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。,.,3、共有指纹峰面积的比值（1）以参照物峰面积作为1（要求能出现稳定的峰），计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标物）。（2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。（3）各共有峰的面积比值必须相对固定。（4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%；若面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。,.,4、非共有峰面积非共有峰总面积不得总面积的10%。5、方法学考察（1）稳定性主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。（2）精密度主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。（3）重现性主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。,.,6、其他注意问题（1）样品定容一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。（2）放置供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。（3）有效数字相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点后3位。（4）留样注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。,.,（5）参照物复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。（6）量化的含义是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在“量”的相对程度。（7）相似度软件2004年SFDA中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。,.,图2福建太子参HPLC指纹图谱,图1福建莲子HPLC指纹图谱,.,第五节研究实例,丹参HPLC指纹图谱构建一、药材来源（GAP基地）与鉴定二、色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸（5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流速为1ml/min。,.,四、供试溶液的制备40目，10批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取，趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过滤。五、测定分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录1h色谱。供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。指纹图谱应有12个特征峰。,.,相对保留时间/min（特征峰序号）0.150（1）、0.368（2）、0.437（3）、0.495（4）、0.591（5）、1.000（S）、1.143（6）、1.393（7）、1.627（8）、2.585（9）、2.911（10）3.968（11）。特征指纹峰面积积分相对比值0.15230%(1)、0.72(2)、0.19130%(3)、0.29725%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)