课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,二、研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,（一）筛选菌株,1、实例PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。,提出的问题如何寻找耐高温的DNA聚合酶？,解决问题的思路寻找耐高温环境。,原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。,获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,选择性培养基,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,加入青霉素(抗生素)的培养基：,（1）概念：,（2）例子：,分离真菌（抑制细菌生长）,不加含碳有机物的无碳培养基：,分离自养型微生物,加入高浓度食盐(NaCl)的培养基：,分离金黄色葡萄球菌,不加含氮有机物的无氮培养基：,分离固氮微生物,3、本课题使用的培养基的配方：,从物理性质看，此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、此培养基选择分解尿素的微生物的原理,5、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离分解尿素的细菌,作为对照判断此培养基有无选择性,只生长分解尿素的细菌,生长多种微生物,是,1.显微镜直接计数,(1)原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。,(2)具体做法：,(3)优缺点：,缺点：不能区分死菌和活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。,优点：能准确统计微生物的实际数目。,每一个大方格边长为1mm，每一大方格的面积为1mm2，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少?,5A,1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）,5AB104,1mm,（二）统计菌落数目,2.间接计数法（活菌计数法）(1)原理：在样品稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个活菌繁殖而来的，即一个菌落代表原先的一个活菌。(2)常用方法：稀释涂布平板法。,(3)计算：每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）设置对照,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,证明培养基未被污染：用空白培养基(不接种)作对照。,证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。,本课题对照设置：,【实例】在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同；操作失误或培养基污染(或混入了其他含氮物质)。,对照一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,对照二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误，是土样问题；如果结果不同，则证明不是土样问题。,如何设置对照排除以上可能原因？,结果预测：如果培养基上长有菌落，则证明是培养基问题；如果培养基上无菌落，则证明不是培养基问题。,三、实验设计,(一）土壤取样,(二）制备培养基,(三）样品稀释,(四）取样涂布,(五）微生物的培养和观察,实验的具体操作.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,实验的具体操作.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。制备牛肉膏蛋白胨培养基。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,实验的具体操作(三).样品的稀释：,实验的具体操作(三).样品的稀释：,（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,实验的具体操作.取样涂布：,注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此可选择一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,实验的具体操作.微生物的培养与观察：,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,实验的具体操作.微生物的培养与观察：,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,微生物的培养与观察,四.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,五、操作提示,无菌操作,做好标记,制定计划,六.课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入