mRNA提取和荧光定量PCR.ppt

RNA的抽提,一、概述,Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,二、试剂,1.DEPC水：1ml1000ml双蒸水1DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20保存（DEPC水需先高压）3.氯仿：棕色瓶4.异丙醇：棕色瓶,三、操作步骤,一、抽提（一）组织抽提（二）细胞抽提1.倒掉培养基，PBS洗，直接将1mlTrizol注入培养瓶（5106），反复抽吸均匀。2.或收集细胞后加入Trizol反复抽吸均匀。,三、操作步骤,二、分相3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒，室温下静置5分钟.4.12000rpm15分钟4C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.40.6ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。,三、操作步骤,三、RNA沉淀6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。7.离心12000rpm10分钟4C。8.RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。,三、操作步骤,四、RNA清洗9.离心管加入1ml预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm12分钟。（有文献称不超过7500g离心）。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4至少保存1周，20至少保存1年。10.室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA，但不能完全干燥(510分钟)。用DEPC水15l溶解沉淀，55-60孵育1015分钟。11.测量OD值后，样品放置70保存，一个月,注意事项,1.电泳检测:制备甲醛变性，1琼脂糖凝胶快速电泳，25ug/lane，65V，2.5h，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带。2.RNA沉淀完全干燥，会极大地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5%SDS溶解RNA，并在5560C下孵育10分钟，当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。3.分离RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0【分离胶范围】500bp1.21.510kp0.30.7二者之间0.81.0【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度及浓度。用什么稀释的RNA，就用其调零。,注意事项,5.预防RNA酶污染6.在分相步骤吸取上清液过程中，和清洗步骤吸弃上清液过程中，都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。7.台式离心机最大能达到2,600g的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。8.当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。,荧光定量PCR,一、原理,FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的53外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。,二、操作步骤,1样品RNA的抽提2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10ml的10MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。,二、操作步骤,准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。,二、操作步骤,3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0.2l3下游引物0.2l4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。,二、操作步骤,混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。,二、操作步骤,反应体系如下：标准品反应体系1SYBRGreen1染料10l2阳性模板上游引物F0.5l3阳性模板下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l管家基因反应体系：1SYBRGreen1染料10l2内参照上游引物F0.5l3内参照下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后931分钟，552分钟，共40个循环。,二、操作步骤,5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：110PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）；72C延伸5分钟。,二、操作步骤,PCR产物与DNALadder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。,二、操作步骤,6待测样品的待测基因实时定量PCR所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。,二、操作步骤,将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按931分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。