流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用PPT课件

流式细胞仪flowcytometry(fcm )、流式细胞仪是指、流式细胞仪的实物、BDFACSVantage、BD-Calibur、1 .发展历史1934模具avan 1973 stein kamp，一、 摘要2 .定义：对高速流动的鞘液中含有的特异荧光标记细胞、粒子进行分析和筛选的技术.3.特征测定速度快，能测定每秒数千个至数万个细胞的多参数测定在分析的同时，还能分离出具有特定特征的细胞，即筛选技术。 可以用荧光素标记的细胞和粒子都可以用流式细胞仪检测。 这种荧光素被配置在流式细胞仪上的激光光源激发，以生物检查技术中流式细胞仪不能多为前提。 4、应用范围、二、流式细胞仪的工作原理和基本结构、待测细胞为单细胞悬浊液，用特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。 流动室充满鞘液，作用：将样品约束在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。 细胞排成一列从喷嘴的中心喷出，形成细胞液柱。 液体柱与激光束交叉，细胞上的荧光色素被激发而产生荧光。 荧光信号变成电信号输出到计算机，进行软件分析。 基本结构、流动室和液体流动系统激光光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统。 三、流式细胞仪可检测到细胞参数、非荧光信号、粒度、细胞大小、前方角散射光(FSC )细胞的相对大小和表面积侧角散射光(SSC )细胞粒度和细胞内细胞的相对复杂性、血液涂层、外全细胞散射光的两参数点图、荧光信号、 有荧光标记的细胞和无荧光标记的区别(阴阳)高FL细胞和低FL细胞的区别(强弱)一般的流式细胞仪只有一个(488nm )激光光源，可以测定三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型流式细胞仪中有两个或三个雷荧光信号和细胞特性，荧光染料被激发发射的光信号。 定量多荧光标记细胞中的标记染色荧光信号幅度的成分的含量的定量多荧光标记细胞的多个成分实现多参数测量，对、和光信号进行分离，并且将光信号引导到各检测通道转换成电信号。 光信号收集、三数据处理和流报告、对数线性对数、脉冲处理、模数转换、光信号、电信号、记录数据、显示结果、(面积、峰值高度、宽度)、流报告的图表通常分为四种最常见的是散点图和直方图。 一些概念： %Gated :阳性细胞的比例。 反映细胞群中阳性细胞的数量。 Mean :平均荧光强度与被检测物质的表达量有关，在正态分布的情况下一般使用。 GeoMean :几何平均荧光强度一般用于阳性细胞为偏态分布的情况。散布图、密度图、二维高图、直方图、图报告中常见的一些流式细胞仪图、图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死、流式细胞仪数据分析、点图分析、流式细胞仪数据分析、滞后图中100101(M1 )为阴性细胞，101以上(M2 )为阳性细胞，五、流式细胞术的应用细胞结构细胞尺寸细胞粒度细胞表面积核浆比例DNA含量和细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/细胞浆/核的特异抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合部位， 细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位，线粒体膜电位一)细胞DNA含量测定细胞固定后用PI(ProPIdiumiodide碘化丙嗪)染色，PI特异性地与细胞DNA结合，因此荧光强度和PI的结合量显示出良好的线性关系，该用于检测细胞周期、细胞多倍体及凋亡。单参数直方图，图中的2N表示G0/G1期细胞，4N表示G2/M期细胞，两者之间表示s期细胞。 这是以二倍体和四倍体细胞为中心的流程DNA图，DNA细胞周期分析，细胞周期：G2，m，G0，G1，s，200，400，600，800，1000，s，DNA分析，DNA含量，细胞数，二倍体，异倍体，四倍体肿瘤组织中各种DNA倍体，含量与凋亡的关系，DNA亚G1峰的检测：利用PI染色检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，使DNA分解为小片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内分解的DNA片段从细胞内流出，整体的DNA含量减少，变成了亚二倍体。 (二)肿瘤诊断和抗肿瘤药的研究，一.肿瘤诊断，DNA异倍体的出现也反映了癌变重要标记细胞的增殖能力的大小，用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。二倍体、异倍体、四倍体、肿瘤组织中各种DNA倍体、2 .凋亡研究，在G0/G1峰之前出现了二倍体峰，即凋亡峰。 检测转归可以进行抗肿瘤药的研究和某些因素对细胞的损伤机制的研究。 AnnexinVAssay， 图AnnexinV/PI双重标记分析细胞的凋亡和坏死，并分析date acquired :14-Jan-03 file :7 gy4HR.001 source : dongbodyiploid :100.00 % dipg0- g 1:73.1 % at96.33 dips :17.29 % G2/g 1:2.00 dip % cv :6.04 apoptosis :13.66 % mean :27.48，图FCM检测细胞周期分布和凋亡，根据凋亡细胞的特征染色体聚集在核膜内侧，新月体、核崩溃的细胞浆和细胞器的密度变高，细胞体积变小的细胞膜的皱纹是卷曲的，初期的细胞膜的完整性没有受到破坏凋亡细胞的FSC吗？ PS？ 细胞坏死的时候，细胞肿了，PS？ PS？ CD3(T细胞、CD4、CD8 )、CD19(B细胞)、CD16、CD56(NK细胞)、原发性或续发性免疫不全症、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖症、肿瘤疗效观察和预后判断、移植免疫检查等。 三)淋巴细胞分类：流式细胞术检查细胞表型，流式细胞术白血病免疫分型利用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，对白血病细胞的免疫表型进行参数分析，知道测定的白血病细胞所属的细胞序列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型，快速、特异、准确、重现性好，可区分细胞起源，划分分化发育阶段等，对白血病的诊断和分类、治疗方案的选择和预后的判断、发病机制的研究等有重要价值。 (4)白血病免疫分型，五)细胞内蛋白的分析：细胞破膜后对细胞内某一蛋白成分进行荧光标记、流式细胞仪测定分析后，与表型分析一样，可以测定该阳性细胞数和该蛋白的相对含量. 荧光探针以FITC居多。 荧光信号用不同荧光标记的单克隆抗体染色，用多种颜色分析荧光信号的强弱，反映细胞抗原的表达量，加入荧光样品的制备、双色直接染色、端粒(荧光蛋白质)、51，6 )细胞内钙离子测定1106/ml的细胞悬浊液用HEPES缓冲的汉克s平衡盐溶液清洗3次，将相同的溶液悬浮在0.5ml中，用流式细胞仪测定。 根据报告的样品的荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。 FCM检测细胞内钙离子、膜电位和线粒体功能，m-1阴性边界区为完全阴性对照的红色部分为阴性对照，即检测到的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、安静状态、基础水平、未受到刺激等。 蓝色部分为阳性组，即受到刺激