课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

专题2:微生物的培养与应用,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,尿素CO(NH2)2是重要的农业氮肥。只有被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,分离产生脲酶的细菌,课题背景,【本课目的】,（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中这样的细菌的数目,1.寻找目的菌株的基本思路是什么？2.实验室中筛选微生物的基本思路是什么？3.什么是选择培养基？4.如何配制能分解尿素的微生物的培养基？为什么能选择出尿素分解菌？怎么证明该培养基有选择作用？5.微生物的计数方法有哪些？平板划线法和稀释涂布平板法都能用于微生物计数吗？6.稀释涂布平板法计数的原理是什么？计算公式是？计数结果偏大还是偏小？,【合作探究】阅读教材P21-P22,一、研究思路,、筛选菌株,、统计菌落数目,、设置对照,（一）筛选菌株,提出的问题如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路寻找耐高温环境；原理高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。,1.寻找目的菌株思路：要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,尝试举例,例1、固氮微生物：用无氮培养基分离；例2、酵母菌和霉菌:用含青霉素的培养基分离；例3、分解尿素的细菌：用尿素是唯一氮源的培养基分离。例4、自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,（一）筛选菌株,选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,1.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？2.从物理性质看，此培养基属于哪类？从功能上看，此培养基属于哪类？3.此配方能否筛选出产生脲酶的细菌，为什么？怎么证明？,碳源：葡萄糖氮源：尿素,能，只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存，不能合成脲酶的微生物不能分解尿素缺乏氮源而不能生长繁殖。另做一组牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,（一）筛选菌株,固体培养基选择培养基,1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察,缺点,（二）统计菌落数目,酵母细胞个数1mL每个小格平均酵母菌数40010000稀释倍数,(1mm1mm0.1mm方格),2.1用2516型计数室计数通常计数四个角及中央的五个中方格(516=80个小方格)的细胞数A，计数重复3次，取平均值。计算公式为：酵母菌个数/1mL=80个小方格细胞总数/8040010000稀释倍数；2.2用1625型计数室计数通常计数四个角的中方格(425=100个小方格)的细胞数A，计数重复3次，取平均值。计算公式为：酵母菌个数/1mL=100个小方格细胞总数/10040010000稀释倍数；,“10000”是指1mL相当于10000个计数室(容积为0.1mm3)的容积,遵循“计上不计下，计左不计右”的原则，交点处个体只记一次。,对每个样品计数三次，取其平均值，,每克样品中的菌株数=（C/V)*MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,（二）统计菌落数目,2.间接计数法（活菌计数法）常用方法：稀释涂布平板法。原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。（3）统计方法：,(1)作样品系列稀释液(2)用适当的稀释液涂布平板,稀释涂布平板法（活菌计数法）,某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34108B2.34109C234D23.4,思考：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,1.操作方法：稀释涂布平板统计菌落数2.原理：1个活菌1个菌落3.统计的数目比实际活菌的数目4.统计原则选30300个菌落的平板统计每个稀释度取至少3个平板取其平均值若三组数据差别大，应重新做实验,（二）统计菌落数目稀释涂布平板法,低,思考：利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解；尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但他在设计实验的时候没有设置对照，也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明力的证据。,想一想,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。,（三）设置对照,究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,你能帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？由此，同学们得出什么启示？,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样（未接种）的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,（三）设置对照,3.目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）设置对照,1.概念：是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。2.作用：比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试条件引起相应的结果,（一）、土壤取样（二）、制备培养基（三）、样品的稀释（四）、取样涂布（五）、微生物的培养与观察,二、设计实验,实验设计,（一）土壤取样1、天然培养基和合成培养基：2、土壤取样：（1）取样的位置：土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。（2）取样要求：铲去表层土。,（二）样品稀释（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30300之间。（三）微生物的培养与观察1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：3037，12d;放线菌:2528,57d;霉菌:2528,34d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,P24,土壤中的细菌总量肯定多于土壤中能分解尿素的细菌的总量，因此选用的稀释范围肯定不同。,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,（四）、取样涂布,2、在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,1、培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,（五）、微生物的培养与观察,（五）、微生物的培养与观察,3、一般来说，在一定的培养条件下，（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征（包括形态、大小、隆起程度和颜色）。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,三、结果分析与评价,1、是否有杂菌污染,3、样品的稀释操作,4、重复组的结果,2、选择培养基是否筛选出菌落,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,五、课外延伸,H2O,细菌合成脲酶，将尿素分解成氨，使培养基碱性增强，PH升高，因此，可通过检测PH的变化来判断该化学反应是否发生。,2、方法：,1、原理：,对分裂的菌种作进一步的鉴定,用生物化学方法鉴定,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过