药理学实验总结

1、 流式细胞术背景：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸又脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS外翻发生在细胞核破裂，DNA片段化以及凋亡相关蛋白出

2、现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。检测原理：用标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合AnnexinV-FITC。正常细胞核早期凋亡的细胞膜是完整的，Propidium iodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与AnnexinV-FITC和PI结合显色，而

3、PI则被排除在活细胞（FITC阴性）和早期凋亡细胞（FITC阳性）之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。样品染色：1、 离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心（300g*8min），收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2、 用冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽PBS。3、

4、 用400ul(200ul)1xAnnexinV结合液悬浮细胞，浓度大约1x10*6cells/ml。4、 在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8度避光条件下孵育15分钟。5、 加入10ulPI染色液后轻轻混匀于2-8度避光条件下孵育5分钟。6、 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注意事项：1、 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。2、 细胞处理要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。3、 AnnexinV-FITC和Propidium iodide(PI)是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露

5、在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。4、 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。5、 使用AnnexinV-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。6、 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与AnnexinV结合。7、 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1x10*5。8、 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解AnnexinV-FITC，最终导致染色失败。9、 对于贴壁细胞，消化是一个

6、关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶的消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响AnnexinV与PS的结合。10、 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、

7、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对试验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。11、 有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度极低，难以染色，此时不适合用AnnexinV方法检测凋亡。细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）样品预处理：动物组织： 1、切取5-20mg的动物组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。 2、然后加400ul ACL Solution 入和10ul的Proteinase K。如有凝结块，可以用枪头吹吸打碎。 3、震荡混匀1

8、分钟，然后置于55C放置20分钟3小时，在此期间间或取出混匀，有助于充分裂解。裂解完全的样品应澄清透明。不同来源的组织，完全裂解时间可能差异较大。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。啮齿类动物（如鼠等）尾巴： 1、从动物尾部末端切取0.51cm的组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。 2、然后加入400ul ACL Solution 和10ul的Proteinase K。 3、震荡混匀1分钟，然后置于55C水浴1020分钟，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。培养成熟的动物细胞： 1、在5001000rpm下离心

9、约35分钟，收集细胞。 2、加入400ul ACL Solution 和10ul的Proteinase K。 3、震荡混匀1分钟，然后置于55C水浴1020分钟，在此期间可以适当取出 混匀，有助于充分裂解。 4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。DNA提取：经过上面预处理的样品按照下面步骤提取基因组DNA。5、 在经过预处理好的样品中，依次加入300ul Ext solution 和 300ul AB solution,用力摇匀，然后12000rpm离心5分钟。溶液将分层，上层为蓝色的抽屉层，下层为透明水相，两层溶液中间可能会有部分沉淀层，DNA在下层水相中。注：如样品量较少或溶液澄清不粘稠

10、，可不添加Ext solution ，只添加300ulAB solution,摇匀后离心。6、 将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液，将下层溶液仔细吸出到GenClean Column中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。7、 8000rpm离心1分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。8、 将GenClean Column放回收集管中，加入500ul Wash Solution,8000rpm,室温离心1分钟。9、 重复步骤8一次。10、 取下GenClean 柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1分钟，以除去残留Wash Solution

11、。11、 将柱放入新的洁净1.5ml的离心管中，在柱中央加入50100ul Elutionn Buffer,室温或55C放置2分钟。然后12000rpm,室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可于4C或-20C保存。乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒1、 试剂盒组成及配制： 试剂一：基质缓冲液 试剂二：辅酶1，配制：每支粉剂加1.3ml双蒸水溶解，溶解后冷冻可保存2周，如需多次使用建议分装冷冻。 试剂三：2,4-二硝基苯肼 试剂四：4mol/l NaOH，0.4mol配制：10倍稀释。 试剂五：2umol/l丙酮酸标准液。2、 测定步骤： 空白孔标准孔测定孔对照孔双蒸水（u

12、l）25550.2umol/ml标准液（ul)20待测样本（ul）2020基质缓冲液（ul)25252525辅酶1（ul)5 混匀，37C温浴15分钟2,4-二硝基苯肼（ul)25252525 混匀，37C温浴15分钟0.4mol/lNaOH溶液（ul)250250250250 混匀，室温放置5分钟，波长450nm，酶标仪测定吸光度。3、 计算及举例： 血清中LDH活性（U/L）=测定OD值-对照OD值/标准OD值-空白OD值x标准品浓度xNx1000（N为待测样本测定前稀释倍数） 乳酸脱氢酶释放率=培养基中酶活性/培养基中酶活性+细胞层酶活性。试验中需要同时检测培养基和细胞裂解后细胞悬液中的

13、乳酸脱氢酶。4、 测定原理： LDH 乳酸丙酮酸 37C水浴丙酮酸 + 2,4-二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙（红棕色） 碱性根据比尔定律，可测乳酸脱氢酶活性。5、 标准曲线制备： 1、前处理：将2umol/ml的丙酮酸标准品用双蒸水分别200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍稀释后按照操作表制作标准曲线。 2、操作表：空白孔标准孔双蒸水（ul)255不同浓度丙酮酸标准（ul)20基质缓冲液（ul)2525 混匀37C温浴15分钟2,4-二硝基苯肼（ul)2525 混匀，37C温浴15分钟0.4mol/l氢氧化钠溶液（ul)250250混匀，室温放置5分钟，波长450nm，酶标仪测定

14、吸光度。免疫细胞化学（免疫荧光染色）1、 试剂及材料： 六孔板、盖玻片、移液枪、枪头、丙酮、PBS、triton X-100、H2O2、BSA、一抗、二抗、湿盒、甘油。2、 方法： 将已灭菌的盖玻片置于6孔培养板中，按10*410*5/ml的密度将细胞接种于培养板中进行爬片，培养612小时，待细胞贴壁后，35天进行免疫细胞组织化学染色鉴定。PBS清洗时将玻片置于小培养皿中。步骤如下： 1、PBS清洗标本3次，各3min. 2、95%酒精（或冰丙酮等其它固定剂）固定15min. 3、空气干燥5min。 4、PBS清洗标本3次，各3min。 5、0.3% triton X-100（PBS配）孵育1

15、次15min. 6、PBS清洗标本3次，各3min. 7、3%H2O2(PBS配）孵育15min. 8、PBS清洗标本3次，各3min. 9、5%BSA(,PBS配）封闭标本3min. 10、一抗（1%BSA配，1:1001:200）4C过夜。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液（湿盒） 11、PBS清洗标本3次，各3min. 12、二抗孵育（湿盒）1%BSA配 ，30min， 避光； 13、PBS清洗标本3次，各3min，DAPI染核5min，PBS清洗标本3次，各3min。 14、95%甘油封片防止荧光猝灭。注意：冲洗时只需轻轻震荡培养皿(易脱片） 加一抗、二抗后冲洗时第一次需将玻片

16、倾斜。核蛋白提取试剂盒1、 产品组成： 提取液A、提取液B、蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物。 注意： 1、蛋白酶抑制剂混合物避免反复冻融； 2、如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 3、蛋白提取液 、磷酸酶抑制剂28C保存； 4、蛋白酶抑制剂-20C保存。2、 使用方法： 使用注意事项： 1、旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 2、实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20C冰箱预冷。整个过程需保持样品处于低温。 3、蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 4、可以根据

17、自己试验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。 5、Western试验内参可以选用LaminA、LaminB、TBP、Histon H3. 细胞蛋白的提取： 1、提取液制备：每200ul冷的蛋白提取液A和B中分别加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。2、 取510x10*6个细胞，在4C，500xg条件下离心23分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。3、 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4、 每20ul细胞压积中加入200ul冷的提取液A，高速涡旋震荡15秒或吹打混匀，置冰上15分钟，中间每隔5分钟涡旋震荡或吹打混匀。5、 再次高速涡旋震荡5秒，然后在4

18、C，12000g条件下离心5分钟。6、 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80冰箱保存备用。7、 沉淀用PBS洗涤一次，然后再4C，12000g条件下离心5分钟，弃上清。8、 在沉淀中加入200ul冷的提取液B,高速涡旋震荡15秒。9、 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋震荡15秒。10、 在4C，12000g条件下离心10分钟。11、 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。12、 将上述蛋白提取物定量后分装于-80冰箱保存备用或直接用于下游试验。注： A.细胞数量根据试验情况调整，每次的提取液用量并不是一定的，请根据 实际情况调整。 B.建议用BCA法进行蛋白定量。 C