第5章基因组变异

1、第5章 基因组的变异51 诱变和DNA修复基概念和定义突变是基因型中可遗传的变化，它由基因组中某一特定区域的核苷酸残基序列变化造成的。这些变化包括以下四种方式的诱变(mutagenesis)： (1)在DNA复制中核苷酸的错误掺入。 (2)对DNA的损伤(可能是自发的，或是被环境中的诱变剂所诱导)以及细胞的修复。 (3)异常重组(例如，末端的连接，复制中链的跳格，不对等的交换)(参见异常重组和不对等交换)。 (4)可移动遗传因子的活性(见可移动的遗传因子)。单个碱基的错误掺人和损伤常产生点突变(point mutations)，也就是一个核苷酸被另一个代替(参见转换和颠换)。基因中的点突变可以

2、改变编码蛋白的性质，那些基因外的点突变会影响一些DNA-蛋白间的相互作用。碱基的损伤还能导致致命的复制阻断。其他形式的DNA损伤(例如染色体断裂)，异常重组和可移动因子的活性往往造成更显著的大突变(macromutations)，这会影响到许多相邻的核苷酸。因此，突变能通过几种不同机制影响基因的功能，经常是有害影响。细胞将许多资源用来维持和修复DNA。它具有保证DNA复制忠实性的机制，同时有在溶液中修复被破坏的核苷酸，修复和取代DNA中被损伤的碱基并调节它们的活性以应答DNA的损伤。所有细胞都有一个自发突变率，定义为一段特定时间内基因组正常发生的突变次数。这个比例反映了DNA复制忠实性和修复的

3、效率。控制这些过程的基因的突变可能会增高或减少自发突变率，这些基因被分别称为增变基因(mutator)和抗变基因(antimutatorgenes)。52 诱变和复制忠实性DNA合成过程中核苷酸的错误掺入 尽管DNA碱基形成特定碱基对，但这不是一个高度精确的过程。从能量上考虑，预计也可以产生1一10的出错频率。复制机构的成分通过三个主要机制将复制的精确度提高了几个数量级。 (1)DNA聚合酶的碱基选择； (2)DNA聚合酶的外切酶校正功能； (3)辅助蛋白稳定复制复合体的功能(例如单链结合蛋白，它限制了模板DNA二级结构的形成)。 当dNTP结合到模板-引物-酶的三元复合体上时，DNA聚合酶具

4、有高度选择性，错配核苷酸的结合没有正确配对的稳定。根据特定的酶，错配的类型和其前后序列的情况的差异，鉴别错误的水平变化范围可从0400倍。这反映了鉴别过程中碱基配对和堆积力的影响。再有，发生在结合之后的以及将dNTP置于酶的活性位置的构象变化的频率，对于形成WatsonCrick配对的碱基来说要大5000倍。正确配对的碱基形成磷酸二酯键的频率也要高一些。这三种鉴别步骤的相对重要性对各种多聚酶是不同的。 校正功能由DNA聚合酶内在的35外切酶活性完成。每一次加入的步骤后都有一个稍微的停顿，这让多聚酶除去错配的碱基，但是校正的主要部分发生在随后的多聚循环的起始。当引物末端和模板错配后掺入的频率非常

5、低，这为外切酶活性提供了一个好机会。因此，校正是一种掌握时机的行为，它由多聚酶不能有效地延伸错配末端这种性质来控制。 在E.coli中，这些因素将积累的出错频率降至每107个碱基对只有一次错误掺入，但这仍比观察到的自发突变率高三至四个数量级。更高的忠实性是由复制后错配修复造成的，它在复制后将新合成链中错配核苷酸纠正过来。DNA中瞬时的、自发的化学变化 与DNA合成相联系的出错频率(在错配修复和校正之前)反映了多聚酶在选择核苷酸时的不精确性。多聚酶内在的性质(就是说，偶尔掺入错配核苷酸的趋向)是造成出错的部分原因，但这也反映了DNA碱基经历自发的、瞬时的变化的能力，这些变化涉及氢原子的重排。这类

6、变化是互变异构移位(tautomeric shifts)，而形成的同分异构体是互变异构体(tautomers)(图141)。所有碱基以具有一定平衡的互变异构形式的混合物存在(尽管对那些出现在DNA和RNA中的碱基来说，一种形式的互变异构体很稳定，且转化成不稳定形式的时间很短)。不同形式的互变异构体可能与互补链中的不同碱基配对。例如，稳定的鸟嘌呤的酮式互变异构体只与胞嘧啶配对，但不多见的烯醇式形式与胸腺嘧啶配对。绝大多数互变异构转化是无害的，因为它们出现在双链DNA中且迅速回到起初状态。然而，如果在复制中模板发生一次变化，就会发生一次错误掺入。如果这不被纠正，一次突变将出现在下一轮复制中。起初错

7、误掺人的碱基不一定会形成突变，因为它可能在被用作模板前被正确核苷酸取代。移码诱变 选择和校正增加了替换的忠实性，也就是掺入一个核苷酸而不是另一个的正确性。DNA聚合酶显示的另一种类型的不忠实性是移码造成的不忠实性，这是在模板复制时与引物链从寄存器(register)滑出时造成的。这个过程，有时称为跳格(slipping)，打滑(stuttering)或震颤(chattering)会产生小的插入或丢失。在编码区跳格会产生移码突变，但这个术语被用来描述所有这类性质的突变而不管它们发生在哪儿。移码诱变更依赖于模板的性质而不是DNA聚合酶。这类突变被重复序列(诱发跳格)和互补区域(便于形成发夹和其他二

8、级结构)激发。这些区域是突变热点。 移码错误会因为加工的减少而增加，这暗示着当多聚酶从模板解离后移码更易发生(这提供了一个可能的解释，为什么观察到的前导链和滞后链合成的忠实性不同，见复制)单链结合蛋白减少移码错误，它增加了单链DNA的稳定性且避免了二级结构的产生。53 DNA损伤：突变和致死DNA损伤 DNA总是在受到攻击，遭受多种损伤。DNA的一个损伤区域被称为一个损害(1esion)。DNA损伤的影响是两方面的。如果一个损害改变了碱基配对的专一性，它被称为误导的损伤(misinstructional lesion)，且可能在下一轮复制中通过图14。1显示的机制产生一个突变。如果一个损害使D

9、NA不能特异于一个互补碱基，它被称为非指导的损害(noninstructional lession)，可能产生一个复制阻断(那儿复制叉被延误了)，这是致死的，因此DNA损伤可能产生突变或致死。为了避免复制阻断的致死效应，细胞发展了损伤耐受机制，这让复制能在损害存在的情况下继续(参见重组修复，SOS反应)。产生于损害位置的突变称为定向突变(targeted mutation)，其他位置的突变，例如归因于复制错误的突变称非定向突变(参见基因导向)。预示突变的损害称为前诱变损伤(premutagenic lesion)。DNA损伤的种类 DNA损伤可以定义为任何不是正常完好无损DNA分子具有的结构，

10、并且如果不处理的话，会造成突变和复制中断，一些类型的DNA损伤列在表51中。表51 DNA损伤的分类和它们是如何产生的损伤类型 定义 起因异常碱基 DNA中除A,C,G,T外的碱基 自发脱氨；物理/化学因素造成的碱基损伤； 复制过程中尿嘧啶和碱基类似物渗入； 化学基团加到碱基上；AP位点 一个无碱基位点（一个碱基从DNA主干上被除去的位点） 自发碱基丢失 异常碱基的酶切缺口(nick) 双链中的一条链丢失一个或多个核苷酸形 外切酶活性造成的缺口(往往与修复有联系) 成的位点 由不完全复制造成的缺口(包括切除引物和 复制上的旁路)切口 双链一条链骨架上的损伤，并没有碱基缺 物理/化学上的对DNA

11、骨架的损伤 失。切口的特点是通过进一步破坏DNA AP位点的去除 末端来阻止简单的重新连接 修复合成后的切口保存 与许多细胞过程联系的外切酶活性断裂(双链断裂) 双链的两条链上的损害，这样分子被切开了 对DNA骨架的物理/化学性的损伤 与某些细胞过程联系的外切酶活性交联 DNA链共价连接造成的损伤 包括链内交联和链间交联) 紫外线诱导的碱基二聚体化，化学诱导的交联自发和诱导损害 DNA可能内在地(由于分子自身性质)或外在地(由于外界因素效应)遭受损伤。自发损害的产生由于DNA分子内在性质或与DNA损伤性化学试剂，例如作为新陈代谢副产物产生的自由基团)。由这些损害产生的突变，加上那些通过复制和重

12、组错误产生的突变，以及可移动遗传因子活动造成的突变组成了自发突变，这是特定生物自发突变率的基础。诱发的损害由称为诱变剂(mutagens)的DNA损伤因子作用形成，然而特定诱变剂和天然新陈代谢副产物造成DNA损伤的分子机制是一样的。这儿，自发和诱变损害的区分变得模糊了。 某些化学反应在DNA中通过自发产生来产生损害这包括脱氨(碱基上失去氨基)和通过水解N糖苷键造成碱基丢失，这个过程根据碱基类型称为脱嘌呤或脱嘧啶。脱氨产生误导损害，造成的后果列于表52。水解造成的碱基丢失产生一个非指导性的AP位点(表51)，它阻断复制。然而在Ecoli的SOS反应(参阅)中，转损害(translesion)的合

13、成可能会越过AP位点发生，且腺嘌呤残基被优先掺入，即所谓的A法则。除了这些内在的自发反应，氧反应因子，例如自由基团，会造成一系列氧化型DNA损害。脱氨、碱基丢失和氧化型损伤也会被诱变剂诱导。表52脱氨造成的结果 正常碱基 互补碱基 脱氨产物 互补碱基 后果 A T 次黄嘌呤 C A-G转换 C G 尿嘧啶 A G-A转换 G C 黄嘌呤 不固定 复制中断 T A 无5甲基胞嘧啶 G T A GA转换四种DNA碱基(加上5甲基胞嘧啶)特异配对的碱基以及它们损伤的产物 环境中损伤DNA且导致突变或致死的因子是基因毒性(表53)的。诱变剂可以是化学的、物理的或生物的因子(表5.4)。化学或物理的诱变

14、剂通过与DNA作用使键断裂或重新排列，或新的键生成。这往往包含增加新的化学基团。生物诱变剂为可移动遗传因子，它们通过转座进入DNA而打断它，它们还造成各种类型的结构重排。表53 基因毒性因子的分类 基因毒性剂 定义 致癌剂 促使真核细胞肿瘤转化的因子。许多致癌物也是诱变剂，但反过来并不总是正确 断裂剂 诱导染色体破裂，也就是双链断裂的因子 诱变剂 通过直接和DNA作用或产生新陈代谢产物来促成诱变的因子 致癌物 诱导肿瘤形成的因子 超诱变剂 特别有效的诱变剂，例如甲基磺酸乙酯 调聚剂 导致复制提早结束的因子，例如2，3二脱氧核苷 致畸(胎)剂 诱导发育异常的因子，不一定是基因毒性因子，就是说包括

15、不改变DNA结构而发挥作用的分子表54 不同种类的诱变剂诱变剂 描述 化学诱变刑 脱氨剂 诱导碱基脱氨的因子，包括非专一性的硝酸和专一地使胞嘧啶脱氨的亚硫酸氢钠。 烷化剂 与核酸的亲核中心反应的分子。它用链烷以及其衍生物来取代亲核中心。这类化学性质往往是强有力的诱变剂，例如MS和二甲基亚硝胺。烷化剂导致多种类型DNA损伤：碱基修饰会改变烷化剂的配对能力，造成复制中的错误掺入。另一方面，一个大型加合物(bulky adduct)会阻断复制。双功能的因子(能使两个亲核中心烷基化)会造成交联。 大型加合物供体 这是一种当代谢后具有能将大型化学基团加到碱基上的活性的分子。例如黄曲霉素B，和苯丙吡。这类

16、反应的结果是形成一个膨胀的扭曲的双螺旋，它会阻断复制。 碱基类似物 这是一些类似碱基的分子，它们能形成可以掺人正在生成的核苷酸链的核苷酸(例如，溴脱氧尿嘧啶)。与主要碱基不同的是，碱基类似物会显示异常的碱基配对性质。例如，它们能与不止一种碱基配对，因为它们在不同的互变异构形式下都能保持稳定。碱基类似物通常用一种高度专一的方式产生点突变。 插入剂 具有平面结构的分子，它能嵌人到DNA的碱基之间(例如溴化乙啶，丫啶橙)。插入因子通过解旋DNA链而增加其长度。这会诱导移码突变，阻断复制且抑制核昔酸的切除修复，这通过使酶束缚在无活性复合物状态来完成。 交联剂 这是使DNA链便于共价连接的分子。这些药剂

17、因子包括双功能性的烷化剂，氮芥和硫芥，铂的衍生物。平面分子，补骨脂素当暴露于紫外光时也会交联DNA。 物理诱变剂 电离辐射 电离辐射导致各种DNA损伤，包括碱基损伤，糖环的损伤，裂口和断裂。电离辐射的效应可能是直接的(由DNA分子中原子电离造成)或间接的(由细胞中其他活性分子产生，主要是活性氧组分(reactive oxygen species)，它们与洲A相互作用)。 紫外辐射 紫外诱导的损伤称为光合产物。紫外辐射的主要效应是产生相邻碱基连接的光合二聚体。最常见的光合二聚体是环丁基嘧啶二聚体，它可在任何两个相邻嘧啶间产生，TT是最普遍的，其他依次为CT，TC，CC另一个常见的光合二聚体是(6

18、4)损害。包含嘌呤的光合二聚体也有形成。紫外辐射也会对单个碱基产生损伤，通常是使其水合作用。对枯草杆菌孢子的辐射会产生一个独特的孢子光合物。 生物诱变剂 限制性酶 这类酶由细菌产生，它们在诸如噬菌体基因组之类的“入侵”DNA上产生断裂(参见限制和修饰系统，限制性内切酶)。 可移动遗传因子 这是能在基因组中移动的DNA序列，例如病毒(比如，细菌噬菌体Mu、反转录病毒)，附加体质粒(比如F因子)和转座遗传因子(如P因子，Ty因子)。由于它们插入或打断基因，而导致诱变的或可能带有基因调控元件来影响编码基因的表达，它们的分散的拷贝可能便于异常重组。53 DNA修复修复机制 如果所有DNA损伤都不修复，

19、细胞将很快死亡，这是因为致死突变的积累和依赖于DNA完整性的一些关键过程被抑制(这些过程包括复制和转录)。细胞发展了众多的机制来处理DNA损伤，这可被分为三大类： (1)直接恢复修复机制； (2)损伤切除和利用互补序列来修复； (3)可诱导的损伤耐受。 尽管有这些防卫措施，细胞最终要衰亡(例如，显然衰老的细胞)。然而，通过损伤避免和修复机制，细胞的衰弱明显地减慢了。 可被直接修复的损伤类型是很有限的。用来合成能特定修复每一种可能损伤的酶系所需的原料肯定是众多的。因此在所有有生命的有机体中的主要DNA修复方式是切除修复。损伤的DNA被除去，利用未损伤链作为模板链在缺口处合成新DNA。这里强调了双

20、链DNA基因组对许多病毒单链基因组的一个重要优势；如果一条链受损，另一条链总能被用来恢复失去的信息。直接的修复和切除因此是准确的，非诱变的或无差错修复(errorfree repair)系统。 在以下几种情况下双链的两条链都损伤了损伤出现在DNA的一个单链区域上(例如复制中的模板链，或切除修复系统饱和了，细胞更能承受非指导损伤而不是经受到复制中断的致死效应。在这些情况下，复制叉能穿过一处损伤，留下一个缺口，它可以通过与一同源双链重组而弥补，在相应处又留下一个原有的损伤。另一种解决方法是，一个能承受损伤的可诱导系统能发挥作用，这时DNA聚合酶可以用降低忠实性的复制经过损伤处。这种倾向差错(err

21、orprone)的修复或诱变修复在Ecoli中产生许多紫外诱导的诱变。 DNA修复机制对存活和保持完整性至关重要。在动物中，DNA修复特别重要，因为影响细胞生长的突变会致癌。一些由于丢失DNA修复功能或失去对DNA损伤的细胞反应而产生的人类疾病列于表55。54 直接恢复性修复 DNA损伤的直接修复 有三类损伤可以直接恢复性修复：简单裂口能直接重连接；某些紫外光合物能通过光复活作用来修复;某些被烷基化的碱基能通过除去加合物修复。还有，有些酶能在受损伤核苷酸加入DNA前将其修复(例如Ecoli中的MutT)裂口的直接修复 如果3-OH端和5-P端完好无损的话，由电离辐射等DNA损伤因子产生的裂口能

22、被直接修复。然而，这类损伤往往包括对末端碱基的修饰，因此在连接以前需要进一步的加工。 光复活 光复活(photoreactivation or photorestoration)是一个依靠光的DNA修复机制，它将某些类型的嘧啶二聚体切开(单倍体化)。这种修复途径在许多细菌中发现，例如Ecoli和沙门氏菌，但在枯草杆菌中不存在，它的主要紫外辐射产物孢子光合物被认为是通过一种类似但不需要光的途径单倍体化的。Ecoli中，用于光复合的酶有许多叫法，如DNA光解酶，脱氧核糖二嘧啶光解酶或光复活酶，它由phr基因编码。这种酶结合到具有嘧啶二聚体的DNA上，当暴露于波长在300500nm的可见光时，将二聚

23、体转化为嘧啶单体。在许多但不是所有低等真核生物内都发现了性质相似的光解酶，但没什么证据证明它在高等真核生物中广泛存在尽管在果蝇中描述了一种能直接修复(64)光合物的光依赖性酶。 光复活不应与其他非酶活性的单体化机制混淆：直接光恢复发生在持续的对DNA紫外辐射下，这反映了相邻嘧啶间建立了一个单体和二聚体间的平衡。致敏光恢复在有色氨酸存在时发生，它提供一个电子而助于单体化。再有，紫外辐射会扰乱其他细胞组分，抑制生长并给光合二聚体的切除修复提供时间，这种现象称为间接光修复。烷基化碱基的直接修复 Ecoli中，O6烷基化的鸟嘌呤和O4烷基化的胸腺嘧啶残基，以及甲基化的磷酸二酯键由Ada酶修复(在其更广

24、泛的底物专一性被发现以前，称为O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶I，O6MGT I)。Ada具有双功能性：其一是将一个烷基基团从碱基的碱式基团上转移，另一个是将一个甲基从甲基磷酸二酯键上转移，从而直接扭转了甲基化因子的效应。Ada被称为一个自杀酶，因为它将烷基转移到自身并且失去活性。第二种烷基转移酶，O6MGT I、II，不能催化甲基从磷酸三酯上转移。在其他细菌和真核生物中都找到了相似的酶，尽管它们对Ada蛋白不同底物的专一性不同。适应反应 E.coli中，环境中低浓度的烷化剂能激发一个修复系统。这种适应反应是SOS依赖性的并和ada、aidB、alkA和alkB基因有关。此alkA基因编码3甲基

25、腺嘌呤DNA糖基化酶，执行碱基切除修复(见下一节)，识别广谱的烷基化碱基。ada基因编码O6MGTI，也就是刚才讨论过的Ada蛋白，它通过从碱基和磷酸三酯键转移烷基到自身来完成对DNA烷基化损伤的直接修复。从磷酸三酯键上移走的甲基被转移到一个胞嘧啶残基的C端。这不仅使蛋白失活，而且将其转化成其自身基因以及aidB，alkA和alkB的正调控因子。由该蛋白修复活动造成的蛋白失活通过诱导基因表达来刺激它的补充。在DNA碱基烷基化频繁发生的同时，由甲基化产生磷酸三酯键只是在细胞暴露在烷化剂危险的浓度时才发生，要除去它们需要更为一致的努力。通过蛋白水解酶对甲基化失活的Ada蛋白的剪切可以终止适应反应，

26、因为某些剪切产物能作为适应反应基因表达的抑制物。aidB和alk2的功能不明。ada和ogt(编码O6MGT)基本上以低水平持续转录，但只有Ada蛋白是遗传调控因子，结果只有ada基因能被细胞内烷基化所诱导。 55 切除修复 碱基切除修复 一种叫做DNA糖基化酶的酶能从DNA中除去特定类型损伤或不合适碱基(表146)。这个过程叫喊基切除修复(BER)。碱基由N糖苷键(图146)的水解除去，这种键将碱基连到DNA主干的糖环上。损伤的一半被切除作为游离的碱基，由此产生另一种类型的DNA损伤，即一个AP位点。 DNA糖基化酶有以下性质： (1)它们识别DNA中损伤的或不合适的单个特定类型碱基，或者一

27、个相关化学加合物的小基团。 (2)它们通过N糖苷键的水解除去碱基。某些糖基化酶还能通过相关的AP裂解酶活性在损伤的3端引入一个切口，但这个行为不是后来的修复步骤必须的，它的生理意义也不清楚。 (3)几乎所有DNA糖基化酶都作用于单个碱基，对涉及多个碱基的更大更复杂的损伤没有专一性。然而，对嘧啶二聚体专一的一个DNA糖基化酶已在噬菌体T4和微球菌属中发现。 (4)大多数DNA糖基化酶识别损伤或不合适的DNA碱基，但其中一些识别正常碱基的酶在措配修复(参阅)中也起作用。碱基切除后的修复完成 在碱基被DNA糖基化酶切除后，产生了一个AP(无嘌呤/无嘧啶)位点。这被第二类叫AP内切酶的专一性修复酶识别

28、，它在AP位点5端引入一个切口。大肠杆菌中有两类AP内切酶： (1)外切酶：起描述为带有相关的磷酸酶活性的35外切酶(因此得名)，实际上该酶的主要生理作用是其5AP内切酶活性。由于其组成型表达，它是主要的AP内切酶，由xth基因编码。其他物种中有功能性同系物。 (2)内切酶：通常只占AP内切酶活性的10，该酶由反映氧化损伤修复重要性的超氧化物诱导。它由nfo基因编码，是啤酒酵母中发现的APN1的功能同系物。 在AP位点5端切割后，另一个酶：脱氧核糖磷酸二酯酶(dRpase)，对于将5端残基水解是必须的。由它产生一个单个核苷酸缺口。DNA聚合酶可能从这个缺口启动修复合成，用一个核苷酸修复块来取代

29、丢失的核苷酸残基。另外，损伤位置的3端的DNA可以被切除，随之是广泛的取代合成。最后，修复合成后剩下的切口被DNA连接酶所封闭。核苷酸切除修复 直接恢复修复和BER都涉及到识别特定DNA损伤的酶。核苷酸切除修复(NER)是一个识别广谱DNA损伤的系统，这些损伤包括交联，大型加合物和涉及多碱基的损伤。这些损伤被一个多功能的酶复合物除去，它产生一个被DNA聚合酶和DNA连接酶修复的缺口。现在还不清楚NER酶是如何识别不同损伤的：其中一些，但不是所有的，导致双螺旋变形。但天然的干扰，例如缠结，发卡结构和错配只能作为不理想的底物。损伤DNA通过磷酸二酯键水解被释放，作为完好无损的核苷酸，或者更常见的是

30、作为核苷酸片段。DNA中嘧啶二聚体的修复在可见光和黑暗情况下都发生：在可见光下，二聚体通过光复活修复(参见)，因此叫光修复，而暗修复是核苷酸切除修复，它通过另一种机制发生。大肠杆菌中的核苷酸切除修复 大肠杆菌中有三种主要NER基因：uvrA，uvrB和uvrC，它们的产物结合起来形成一个依赖ATP的内切酶(也叫UvrABC内切酶或切除酶，叫切除酶是因为它与切除有关。图142)。两分子的UvrA结合到一分子的UvrB上，这个复合物再结合到损伤DNA上(UvrA的功能可能是运载UvrB蛋白)。然后UvrA解离(其中必须ATP的水解)，UvrC的结合造成一个构象变化，这让UvrB在损伤的3产生一个切

31、口。然后UvrC蛋白产生5切口。UvrC的结合和随后的双位点切割(bimodal incision；)需要ATP的结合但不需其水解。5端的切割常在损伤处上游8个核苷酸的位置，而3端切割位点根据损伤的性质更加多变。5和3的切割位置都会受前后序列影响。产生的寡核苷酸片段被z42JrD基因编码的DNA解旋酶II切除。同时除去了UvrC蛋白，1k UvrB横跨在两个缺口上，这可能是保护单链区域免受进一步的损伤。DNA聚合酶结合到暴露的3羟基上并越过缺口合成。在此过程中，同时除去UvrB，产生个大约12个核苷酸的修复补钉(patch)(这类修复有时称为短补钉NER)。最后的切口被DNA连接酶封闭。 Uv

32、rABC内切酶以低水平组成型表达，但uvrA和uvrB基因也可通过SOS诱导(参见SOS反应)。第二种核苷酸切除修复过程，它也与uvr基因有关且也是SOS诱导性的，可以造成大到2kb DNA的切除和取代。这种称为长补钉NER现象的，具体机制还不清楚。 核苷酸切除修补优先以活性基因已转录链为靶。当转录被DNA损伤中断可能会诱导切除修复。一个由mfd基因编码的称转录修复偶联因子(TRCF)的蛋白能结合到拖延的RNA多聚酶DNA损伤一RNA复合物上，并取代转录机制。TRCF还结合UvrA，这显示一旦结合到损伤DNA上，它可能特异性地将uvrAuvrB复合物招募转到模板上。 真核生物中的核苷酸切除修复

33、 真核生物中核苷酸的切除修复与一大群基因有关。酵母中，这些基因归到RAD上位群(参见上位)。因为其中大多数已经在对辐射敏感的遗传筛选中被鉴定。人类的酵母RAD基因同系物起初称ERCC(切除修复的互补成分)基因，但许多都引起特殊疾病表型，例如着色性干皮病，因而这些基因被重新命名(表147)其他NER基因也被鉴定，因为它们对转录也是至关重要的，并显示了真核细胞转录和修复的紧密联系。这种联系的基础是普遍的转录因子TFIIH，它既是细胞基本转录装置的一个重要成分，也是修复蛋白复合物修复体(repairosome)的主要成分。在转录复合物中，TFH的核心与一个依赖细胞周期蛋白的激酶复合物(在哺乳动物中是

34、CDK7/细胞周期蛋白H和装配因子MATl，参见CAK)结合，而在修复时，它与其他修复蛋白结合。因此，修复总是优先被引导到活性转录基因的已转录链(即转录偶联修复)，并且转录正在进行时修复更活跃即转录依赖性修复(transcription dependent repair)。核苷酸切除修复机制在真核生物与细菌中很相似，都是先切割两端再切除之并重新合成。人类中核苷酸切除后的修复补钉比大肠杆菌中的(30nt)要稍微长一些，被含糊地称为长补钉修复，这用来与碱基切除修复中的12核苷酸的短补钉修复相区别。现在还没有证据证明真核生物中有像大肠杆菌中那样的大于1500bp的长补缀修复。 56错配修复碱基错配和

35、错配修复 错配修复是一种纠正双链DNA中碱基对错配的切除修复过程。一个错配是一个非WatsonCrick碱基对，尽管错配修复系统也纠正小的(小于4个核苷酸的残基)插入和删除从而不仅有助于取代的忠实性，还有助于移码突变的纠正。错配修复和其他形式的DNA修复不同的是被切除的物质是正常的(未损伤的)DNA中常见的碱基，因此肯定有一种机制来区分正确和非正确的链，这样模板链中诱变的核苷酸而不是正确的核苷酸被除去。 错配能通过几种方式产生：复制中的错误掺入；重组时形成异源DNA双链；5甲基胞嘧啶的脱氨产生胸腺嘧啶(见DNA甲基化和外遗传调控)。还有，短的插入或删除能通过下面方式形成：DNA复制中链的跳格；

36、产生一个不相等的异源双链。 错配修复不影响非常相似序列间的重组，但减少了明显有差异序列间的重组，因为产生了重叠的切除区域。因此该修复系统能充当明显有差异的，但不是生殖隔离的生物体间的物种屏障。 大肠杆菌中的大补钉修复 复制中引入的错配修复被专一性地从新生链中切除，让正确序列越过产生的缺口重新生成。这称为复制后的错配修复，将替换和移码的忠实性提高了几个数量级。修复被引导到子链，因为它暂时还未被甲基化。GATC顺序中的腺嘌呤残基被DNA腺嘌呤甲基化酶在N位置甲基化(参见Dan甲基化酶)，但在复制后，在该酶对新合成的子单链完成甲基化之前还有一段时间差(见第7章DNA甲基化)。在这段时间里，细胞能区分

37、亲本链和子链，因而将修复引导到子链。如果两条链都未甲基化，修复仍会出现，但不会偏向哪一边，如果两条都甲基化了，修复仍不会偏向，但效率要低得多。 四个基因(mutH，mutL，mutS和mutD)对长补钉修复来说是绝对需要的。它们是增变基因，因为影响它们功能的突变会改变DNA复制的忠实性，因而改变了自发突变率。MutS蛋白识别错配DNA，其效果要根据错配类型和前后序列而定(G：T和A：CG：G和A：AT：T，C：T和G：AC：C)未甲基化的GATC序列作为MutH的底物。MutH是一个内切酶，在这个位置的子链的切口，也就是紧靠有鸟嘌呤残基的5端，使包括错配核苷酸的补钉得以切除。MutS、MutL

38、、ATP和二价阳离子以及MutH的内切酶活性是需要的，并且切除时UvrD是必需的DNA解旋酶。 因为MutH只有在错配存在时才行使功能，所以修复蛋白，GATC位点和错配必需发生物理相互作用。这种模型由一种论证的支持。这种论证认为，无论错配位于最近的GATC位点的5端还是3端，切除修复总是取最短路线。从GATC开始而在错配的大约100个核苷酸以外的位置结束。由于UvrD是一个53的解旋酶，这要求它处在甲基化的链来修复5错配，并且处在未甲基化的链来修复3错配，这是一个需要两个位置问相互作用的机制。根据错配的位置还需要不同方向的外切酶。图143显示了一个错配修复的模型。其他有机体的长补缀修复 与大肠

39、杆菌MutHLS错配修复同源的系统已在其他的细菌和真核生物中被发现，尽管在许多细菌和所有真核生物中修复不依赖于甲基化。链的区分可能涉及切口的识别。这些切口是在被DNA连接酶修复前的复制中产生的(这些切口可能在后滞链中自然产生，而在前导链中被特意地引入，见复制)。结果，大肠杆菌mutS和mutL(但没有mutH)的真核同系物已被分离，列于表148中。在酵母和人类细胞中，每一种大肠杆菌基因至少有两种的同系物，它们的产物形成异源二聚体。真核基因MLHl和MSH2被认为在插入/缺失错配修复中发挥主要作用，因为它们的任一个发生突变都会造成微卫星的不稳定性，这在人类中与遗传性非多发性息肉着色性癌(here

40、ditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)有关。短补钉错配修复 原核生物和真核生物二者都有以短切除补钉为特征的错配修复系统，特别是少于10个核苷酸长度的补钉。在大肠杆菌中，有两个不依赖于mutHLS错配修复的系统： (1)MutY依赖的修复取代A：G和A：C错配中的腺嘌呤残基。MutY编码一个DNA糖基化酶(参见碱基切除修复)，它的主要职能是除去腺嘌呤残基，对面的8oxo7，8二氢脱氧鸟嘌呤残基，但它也能作用于错配。 (2)松短补缀(VSP)错配修复纠正G：T错配中的胸腺嘧啶。这发生在Dcm甲基化酶的靶顺序CG(AT)GG(见第7章DP4A甲基化)

41、；内部的胞嘧啶残基被修饰成5甲基胞嘧啶并且通过脱氨可能被转化成胸腺嘧啶。VSP修复需要mutS和mutL但不需要mutH和uvrD基因的产物。它还需要vsr，其编码一种内切酶，该酶对顺序CT(AT)GG中的GT错配有专一性。 哺乳动物中一种短补钉修复已被鉴定，它纠正G:T错配中的胸腺嘧啶，特别是在CpG模体中。这同时也是一种DNA糖基化酶，它像大肠杆菌的VSP那样作用，阻止5P基胞嘧啶脱氨造成的突变(见第7章DNA甲基化)。 57重组修复重组修复的证据 重组修复是涉及同源重组(参阅)在内任何的DA修复或损伤耐受的战略。停留在G1和G2期的单倍体酵母对电离辐射的不同敏感性证实了这种修复机制的存在

42、(这对静止期和对数期的细菌细胞也是类似的)；每种情况下，具有更多基因组拷贝数的细胞抗性更强。重组修复的更直接的证据来自对大肠杆菌和啤酒酵母的重组缺陷突变体的研究，它们也是辐射敏感的。重组修复的机制 重组修复有两种底物：双链断裂和单链缺口。对于在同源依赖性修复中有关的机制，见重组中的图253。双链断裂可以通过两种方式修复，要么是一种交换修复(双链断裂修复)，要么是一种非交换修复(合成依赖的链退火修复)，后者出现在特化的系统，例如P因子的转座和酵母交配型的转换。当复制在一处非指导性损伤阻断时可以产生单链缺口，并在下游重新启动合成，在损伤模板链的对面处留下一个缺口。这个缺口被一个姐妹双链的同源区域所

43、填充称子链缺口修复(DSGR)或复制后修复(PRR)。利用游离的，互补的姐妹双链作为模板可对有缺口的子链进行修复合成。注意，这个过程并没有实际修复模板链起初的损伤。正如此名称所暗示的，是子链被修复了；起初的损伤仍保留在基因组中，除非通过切除去掉。DSGR是一个主要的损伤耐受机制，它在大肠杆菌中作为SOS反应(参阅)的一部分被诱导。 58 SOS反应和诱变修复SOS反应的调控 大肠杆菌的SOS反应是对DNA损伤的一个可诱导的反应，它导致DNA修复能力增加，细胞分裂的抑制和代谢的改变。该反应由大约20个SOS基因(表149)的活化来介导，由于LexA阻遏物的转录的抑制SOS基因在正常情况下以低水平

44、表达，该阻遏物结合在每个基因上游的操纵子序列(SOS框)。LexA对不同操纵子有不同的亲和性，因而SOS基因被不同的反应阂值所诱导，这些阂值导致当只有部分SOS反应被活化时才观察到的表型分裂(split phenotype)现象。LexA基因自身上游也有一个低亲和性的SOS框，因此它能抑制其自身合成，但该系统是渗漏的，此有利于对其他的SOS基因充分阻遏。当DNA被广泛损伤，单链区域被暴露出来。单链DNA与RecA相互作用产生一个叫RecA*的活性复合物，它通过增加LexA本身的蛋白水解率来帮助切除LexA阻遏物。被切割的LexA蛋白不能再结合到DNA上，SOS基因被解除抑制。当受损DNA在细胞

45、中不再存在，RecA失活，不再有利于LexA的剪切。这样细胞中高浓度的未剪切LexA蛋白从现存的lexA mRNA池中迅速积蓄，而lexA基因和其他SOS基因被关闭。这是一个典型的负反馈循环。SOS诱变 伴随着SOS反应，DNA修复能力的增加对于涉及核苷酸的切离和重组碱基的修复过程的组成基因的部分上调节是适当的(uvrA和uvrB但不是uvrC具有SOS框，就像recA和recN那样)。在这两种机制都精确的同时(无差错修复)，第三种系统，其只在SOS反应中被诱导并涉及umuC，umuD基因，增强了DNA的修复，但也导致突变发生(倾向差错或诱变修复)。这种SOS诱变在突变前的非指导性损伤处特异性

46、出现，也会通过忠实性降低的不可读模板链合成产生(转损伤的合成)。UmuDC操纵子的突变，使得一些细胞对于复制中断的紫外辐射和其他诱变剂诱变是不易变的，但对这些诱变剂的致死作用更加敏感，这与转损伤合成能力的丢失是相称的。这些突变体仍然对产生复制中断，导致碱基错配的诱变剂敏感。 转损伤合成的精确机制还不清楚；UmuDC蛋白可能与DNA聚合酶III相互作用并降低其选择性和(或)校对能力。依赖UmuDC的倾向差错修复在一般情况下被强烈阻遏，因为其活化的三个步骤都需要RecA*蛋白。 (1)RecA*剪切LexA阻遏物来恢复umuDC的转录。 (2)RecA*剪切UmuD(一个无活性前体)来产生活性Um

47、uD，(未剪切的UmuD不仅在倾向差错修复中无活性，而且通过将UmuD束缚在无活性异源二聚体的状态来抑制倾向差错修复)。 (3)RecA*可能有助于将UmuD2UmuC蛋白复合物定位于损伤处。 SOS反应对噬菌体感染的影响 一些病毒具有对宿主细胞有义损伤已引进了一种机制，并运用RecA系统。活化的RecA*复合物诱导剪切，不仅仅是LexA和UmuD，还有噬菌体人的CI阻遏蛋白，因为这三种蛋白都具有一个共同的自我蛋白水解模体。CI抑制蛋白负责维持溶源化，它的失活预示着裂解周期的到来(见第30章病毒，文框301)。通过这种办法，通过例如紫外辐射方法激发SOS反应诱导入前噬菌体的切离。诱导入所必须的

48、DNA损伤水平要比引发SOS反应所需要的高得多，这是因为CI阻遏蛋白对RecA*的敏感性相对低一些。基因组受损的噬菌体被引入宿主细胞后一般存活率较低。然而，如果宿主在被感染前被紫外辐射过，噬菌体能存活。这种现象，称Weigle复活(W复活)，伴随着一个更高的噬菌体突变频率(Weigle诱变)并反映了SOS反应的诱导，导致对噬菌体基因组的迅速修复，其中一些是依赖UmuDC的倾向差错修复。其他物种的趋向错误的修复 除大肠杆菌外，像SOS那样的倾向差错修复很少在细菌中发现，因此大多数细菌对紫外诱导的诱变有抗性，尽管更容易被杀死。功能上和umuC，umuD同源的基因在几种接合型质粒中发现。也有一些有限

49、的证据证明真核生物中有诱变修复。 5.9 基因组的突变5.9.1基本概念与定义突变(mutation)：在基因组的某一特定区域核苷酸序列发生改变而引起的基因型稳定的可遗传的改变参见外突变(epimutation)，副突变(paramutation)。带有某一特定突变基因的基因组，细胞或个体被称为突变体(mutant)。突变可能是局部的(即影响单个核苷酸或一小簇核苷酸)，也可能包括基因的大片断。在前一种情况中，所谓的基因突变(gene mutation)发生在某一基因内部，会影响基因产物的性质或干扰其表达，而基因外突变(extragenic mutation)往往不产生效应(除非它们破坏了调控元

50、件)。大范围的突变可能涉及几十到上千个核苷酸，影响整个基因或一组基因。在真核生物中，最大的突变在细胞遗传学水平上是可见的，并被称为染色体突变(参见染色体突变)。基因突变使一个基因的等位形式变成了另一种。对许多基因座而言，野生型等位基因在群体中占优势。这是因为这样体现了最大的适合度(fitness)(指生存与繁殖的能力)。这种基因往往编码正常的功能性产物，此野生型表型(wild-type phenotype)反映了正常的基因活性。另外，少数等位基因由突变型等位基因(mutant alle1es)所主导，那么编码的产物的量和/或结构性质可能会不同，从而产生不同的突变体表型(mutant pheno

51、types)。偏离野生型的基因突变大部分是有害的或是选择中性的，只有极少数是有益的。除了单一的野生型等位基因，在一群体中可能存在着几种相同的适合度的等位基因相互平衡。那么这个基因座被称为多态性(polymorphic)的。如群体已处于一新发生的有益突变的过渡状态，或如存在对多个的等位位点的平衡性选择，多态现象也可能涉及到不同适合度的多个等位基因。存在着多种不同的力量保持或改变一群体中等位基因的发生频率，如突变压力、迁移、随机遗传漂变及自然选择。自然选择排除了适合度降低的等位基因。所以能存活的突变的突变范围与位点具有明显的偏向，导致功能上重要的DNA序列是进化保守的。在某一环境中有害或中性的等位

52、基因在另一环境中可能是有益的，或者有赖于它在群体中的发生频率。在现代群体某一基因座位的野生型等位基因可能在进化史的早期曾是一非常稀少的突变等位基因。单细胞生物将新发生的突变传递给所有得到接受其染色体的后代。但在多细胞生物中，突变可能发生在生殖系统(形成的配子的组织)或躯体组织中。只有生殖或生殖系统突变(germinal or germline mutation)方可传递给后代。体细胞突变(somatic mutation)无法传递给后代，除非它能成为体细胞的无性生殖。在后一情况下，根据体细胞突变发生的时间和位置不同，可能只影响单一细胞，在一野生型的背景下产生一突变细胞的克隆。或者如果体细胞突变

53、在发育早期发生，可能产生一嵌合体。影响生长控制基因的突变可能引发癌症。5.9.2突变的结构分类 根据突变涉及的DNA序列性质与数量的不同，可以分为四个结构类别。这四类突变由不同机制引起且具不同的效应。 点突变发生于单一位点并涉及少数几个核苷酸残基。如核苷酸发生在一基因内部，产生的效应依赖于所编码的多肽链的表达情况与结构的改变，可能是中性的，也可能具很大的危害。基因外的点突变往往是中性的，但它们如果发生在调节元件中可能改变基因表达的水平与时相。 复杂突变比较少见。它们由一簇点突变组成。一般反映了在同源重组时在异源双链DNA中发生的基因转变(gene convertion)，它们可能与DNA修复相

54、联系，也可能与修复关系不大。重组序列可能是等位的(经典基因转变)，也可能是非等位的(常常包括同向与反向的重复序列)。后者可能导致协同演化(converted evo1ution)。 大突变是染色体结构上的突变大的缺失，插入或重排，其中最大的在细胞遗传学水平上可见。它们往往导致基因的破坏或丢失，并且有时引起基因融合效应，位置效应或基因剂量效应。 染色体不平衡是染色体数量上的突变整条染色体或偶尔整套染色体的缺失或增加。染色体不平衡引起多个基因的剂量效应，在哺乳动物中往往是致命的。5.9.3突变的功能效应一般原理 不论一种突变本身会引起何种效应，这种效应是否反映到表型的水平取决于另外的几种因素。 (

55、1)显性：在二倍体中，突变体等位基因相对于野生型等位基因是隐性的，它的影响在杂合子中不会表现出来。 (2)遗传背景与环境：突变等位基因的效应受到非等位基因的相互作用(如丰余基因，外抑制基因的突变)或环境因素(如互养)的补偿，即使在纯合状态下也不会显示出来。 (3)镶嵌性：在多细胞生物中，体细胞突变的效应取决于突变细胞的所占比例与分布。 (4)单个等位基因表达：在哺乳动物中，印痕(imprinted)基因及非活化X染色体上的基因(在雌性个体中)是外遗传抑制的。因此一种突变的效应取决于它的亲代来源及包含特异的非活化的X染色体的细胞克隆的分布。很多突变不引起表型的变化。因为突变位点(mutation site，基因组内突变发生的位置)不影响基因的功能和表达或更高级别的基因功能(如DNA复制，有丝分裂分离)。这一类突变被描绘为选择性中性，因为它不影响个体的达尔文适合度，它们中包括很多基因外突变。很多能产生表型改变效应的突变发生在基因或调控元件内部并能控制这些基因或元件。这种突变的靶序列有三种：基因的编码区域；位于转录单元内的非编码序列；或转录单元外的非编码序列。 很多位于基因内部的点突变是中性的，这是因为它们没有改变编码产物的结构或表达情况。而那些改变了其编码产物的结构或表达情况的点突变往往是有害的或是中性的其中很少是有益的