动物组织中总RNA的提取PPT演示课件

1、1,实验二 动物组织总RNA的提取,1.关于RNA:rRNA(80-85%)5S,5.8S,18S,28S 120,160, 1874,4718个核苷酸组成 tRNA(15-20%) 7090个核苷酸组成 mRNA(1-5%)1.5-2.5kb,一原理,2,2.用途,体外蛋白质的生物合成,Northern 杂交:主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱,通过RT-PCR建立cDNA文库,3,通过寡聚脱氧胸苷（OligodT）制备mRNA 由于mRNA末端含有多poly(A)

2、+，当总RNA流径oligodT纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板,4,破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA溶解RNA鉴定RNA 保存RNA,1、 破碎组织:可以用盐酸胍、异硫氰酸胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入-ME可以抑制RNA酶活性,3.原理,5,2、 分离RNA:一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开,3、 沉淀RNA:一般用

3、乙醇、3M NaAc或异丙醇,6,4、 洗涤RNA:使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解,5、 溶解RNA一般使用TE,6. 鉴定RNA,7,6. 鉴定RNA,紫外吸收法: 浓度:OD260=1时,RNA为40ug/ml,纯度:OD260/OD280=1.8-2.0 小于1.75:蛋白质污染 大于2.0 :DNA,有机溶剂污染,8,7、 保存RNA:应该尽量低温,为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝

4、脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70,9,二.操作步骤,一).总RNA的提取,1.匀浆(准备室准备):裂解组织细胞, 使RNA酶失活, 使核酸从核蛋白中解离出来(RNP=PNA+Pr.,2.取1ml匀浆液至消毒的1.5ml的eppendorf管中,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15sec,室温放置3min,12000rpm离心10min,10,3.吸取上层水相转移至干净的eppend

5、orf管中,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置20min,4. 12000rpm离心10min,弃上清,5.加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀. 12000rpm离心3min,弃上清,室温干燥5-10min,6.加入30-50ulRNase-free ddH2O,充分溶解RNA。将所得RNA溶液置于-70度保存待用,11,二).鉴定（1.5%琼脂糖电泳鉴定,1、制胶：1.5%琼脂糖加热溶解冷到60加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化 2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer 3、电泳80-120v,30分钟 4、紫外灯下观察结果,操作,12,三.注意事项,防止RNA酶的污染,

6、1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。 2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换,避免在操作中聊天,13,常见的RNA酶抑制剂,1.DEPC（二乙基焦碳酸）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2、

7、异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3、 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4、 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5、 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用,14,确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法： 取RNA样品两份,把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20冰箱中保存1 h。取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70保温的样本有明显的降解，则说明RNA