细菌染色和涂片观察的方法

1、细菌的染色和涂片观察 第一节第一节 不染色标本检查法不染色标本检查法 v所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经染 色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形 态及运动状况的一种检查方法。这种检查方 法虽可看到细菌的大致轮廓，但主要用于观 察细菌的动力。 一、不染色标本检查法的具体方一、不染色标本检查法的具体方 法法 v1 、压滴法、压滴法 v2、悬滴法、悬滴法 v3、毛细管法、毛细管法 第二节第二节 染色标本检查法染色标本检查法 v所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细菌 进行染色，而后再检查其形态、大小、排列 方式、染色反应以及特殊结构的一种检查方 法,有助于细菌的初步识别或诊断。 细菌染色的一般程

2、序细菌染色的一般程序 v细菌染色的基本程序是： v涂片 固定 （媒染） 染色 （脱色）（复染） 1、 涂片制备：涂片制备： v随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可直 接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液体培 养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培养基上 的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中央， 然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使 呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的 涂面，在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气 中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。 2、 固定：固定： v染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和其 它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻片上

3、以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常不易使 染料透入细胞内）。 v 固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的 时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞、 重金属盐或氧化剂等进行固定。 3、 媒染：媒染： v媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使染 料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的物质 统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味酸、金 属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂可用于固 定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之 后复染之前进行。 4、 染色：染色： v随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加染 液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而定。 单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀释石炭

4、 酸复红等；而多数染色法需用第二种染液进 行复染。 5、 脱色：脱色： v脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目的 是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为鉴别 染色之用。 v凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或呈 溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质的电 离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响细菌与 染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负电荷，故 可作碱性染料的脱色剂。 6、 复染：复染： v已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染以 便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对 比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜太强， 以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。 常用染色法常用染

5、色法 v细菌的常用染色法有：单染色法、复染色法、 特殊结构染色法、负染色法以及荧光染色法 等。 （一）、单染色法：（一）、单染色法： v单染色法是指用一种染料进行染色的方法。 如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌 均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示 细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。 （二）、复染色法（二）、复染色法： v复染色法是用二种以上染料进行染色的方法。 此法除显示细菌的形态、大小外，还有鉴别 细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。常 用的鉴别染色法有革兰氏染色法及抗酸染色 法。 1、 革兰氏染色法（革兰氏染色法（Grams Stain） v是最常用的鉴别染色法之一。此染色法

6、是由 丹麦细菌学家 Christian Gram氏于1882 1884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使 用，是细菌学中最为经典的染色方法。 （1）、革兰氏染色的方法：）、革兰氏染色的方法： 固定初染媒染脱色 （结晶紫或龙胆紫） （ 卢戈氏碘液） （95%酒精） 复 染 （稀释复红） 固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN”（ Grams Negative）表示。 革兰氏阳性葡萄球菌例子革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄金黄 色葡萄球菌色葡萄球菌 x 1000) 革兰氏阳性链球菌例子革兰氏阳性

7、链球菌例子 革兰氏阴性杆菌例子革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌大肠杆菌 x 1000) 革兰氏阴性弧菌例子革兰氏阴性弧菌例子 革兰氏阳性产芽孢杆菌例子革兰氏阳性产芽孢杆菌例子 革兰氏阳性短杆菌例子革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特李斯特 菌菌 x 1000) 革兰氏阴性弯曲菌例子革兰氏阴性弯曲菌例子 革兰氏阳性棒状杆菌例子革兰氏阳性棒状杆菌例子 革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操 作技术及菌龄等有密切的关系。 培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳 性菌可变为革兰氏阴性菌。 培养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。 操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴 性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时

8、倘酒精作用 时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。 菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长 过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳 性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为 革兰氏阴性。 革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少， 与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性 降低，使在细菌细胞内着色的染料结晶紫与碘 的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴 性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒精 接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使 细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料 碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被 染成红色。 3）、革兰氏染色法

9、的临床意义）、革兰氏染色法的临床意义 v、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP菌 与GN菌两大类，这样可以初步识别细菌、缩 小范围，便于进一步鉴定。 v、了解细菌与致病性的关系：大多数GP菌 的致病物质主要为外毒素；而大多数GN菌的 致病物质主要为内毒素。通过革兰氏染色， 可了解细菌的致病物质，从而做出相应的治 疗对策。 、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等 结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感 性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、 头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗 生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、庆大霉 素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原 菌的革兰氏染色性，选择有效的药物

10、进行治 疗。 2、 抗酸染色法抗酸染色法 v有些细菌如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌， 用一般染色法不易着色，必须使用强染色剂 （如石炭酸复红）并采用加热和延长染色时 间的方法才能使其着色。且一旦染上颜色后 又不易被酸性酒精脱色。这种能够抵抗酸性 酒精脱色的细菌，称为抗酸杆菌。应用这种 原理进行染色的方法叫抗酸染色法。抗酸染 色法常用的有萋纳二氏染色法和潘本汉氏 染色法。 染色的步骤： 直接涂片法 夹层杯液基集菌法： 固定初染脱色复 染 石炭酸复红加热 3%盐酸酒精 吕氏美兰 染色过程中的细菌颜色变化： 抗酸杆菌 非抗酸杆菌 镜检与报告： 用光学显微镜镜检(目镜10，油镜100)染色痰片。在淡

11、蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。 所见结果按下列标准报告： v 1)抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸 杆菌。 v 2)抗酸杆菌(1+)： 19条抗酸杆菌100视野。 v 3)抗酸杆菌(2+)： l一9条抗酸杆菌10视野。 v 4)抗酸杆菌(3+)： 19条抗酸杆菌每个视野。 v 5)抗酸杆菌(4+)： 10条抗酸杆菌每个视野。 抗酸染色的意义： 用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风 杆菌）和非抗酸菌。 （三）、特殊结构染色法（三）、特殊结构染色法 v细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆 颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用 普通染色法不易着色，须用一些特殊染

12、色法 才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色 法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染 色法等。这些染色法不仅能使特殊结构着色， 还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有 利于观察和区别。 在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外， 由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高、 染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能使 特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽孢 部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染色 法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊结 构染色法 （四）、负染色法（四）、负染色法 v所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染色 方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红或水 溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细