分子光分析j课件

1、2021-8-8 分子 发光 分析j 课件 第十二章第十二章 分子发光分析法分子发光分析法 一、分子荧光与磷光产生过程一、分子荧光与磷光产生过程 luminescence process of molecular fluorescence and phosphorescence 二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 三、荧光的产生与分子结构的三、荧光的产生与分子结构的 关系关系 relation between fluorescence and molecular structure 四、影响

2、荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 influenced factor of fluorescence 第一节第一节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光 molecular luminescence analysis molecular fluorescence and phosphorescence 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence and phosphorescence 基态（S0）激发态（S1、S2、激发态振动能级） 吸收特定频率的辐射； 激

3、发态 基态：多种途径和方式（P344能级图） 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2. 电子激发态的多重性电子激发态的多重性 电子激发态的多重性：M = 2S + 1 ，S 为电子自旋量子数 的代数和（0或1）； 平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），三重态能级比 相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态； 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 3. 激发态激发态 基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁（发光

4、）和无辐射跃迁等方式失去能过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能 量。量。 传递途径传递途径 辐射跃迁 荧光磷光内转移外转移系间窜跃振动弛豫 无辐射跃迁 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 21 3 外转换 2 T2 内转换 振动弛豫 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 振动弛豫：振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级 转至较低振动能级的过程，其速率极快，约转至较低振动能级的过程，其速率极快，约10-14-1

5、0-12s。 内转换：内转换：相同多重态的两个电子能级间，由高能级回到低相同多重态的两个电子能级间，由高能级回到低 能级的分子内过程，取决于两能级的能量差，约能级的分子内过程，取决于两能级的能量差，约10-13-10-11s。 外转换：外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转 换而使荧光换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。（或磷光）减弱甚至消失的过程。 系间窜跃：系间窜跃： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多 重态发生变化的过程，其速率极慢，约重态发生变化的过程，其速率极慢，约10-6-10

6、-2s。 无辐射跃迁无辐射跃迁 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 荧光：荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。动能级回到基态所发出的辐射。多为 S1 S0跃迁 寿命为寿命为10-7 10 -9s，由于是相同多重态之间的跃迁，由于是相同多重态之间的跃迁， 跃迁几率大，速度快。跃迁几率大，速度快。 磷光：磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。态所发出的辐射。 T1 S0 跃迁 磷光寿命为磷光寿命为10-4 10s，由于磷光的产生伴随自旋多，由于磷光的产生伴随

7、自旋多 重态的改变，辐射速度远小于荧光。重态的改变，辐射速度远小于荧光。 辐射跃迁辐射跃迁: 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 21 3 外转换 2 T2 内转换 振动弛豫 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 二、激发光谱与荧光（磷光）光谱二、激发光谱与荧光（磷光）光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum 任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱

8、。 1. 激发光谱曲线激发光谱曲线 如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照 射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵 坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。（图中红线）。 2. 荧光（磷光）光谱曲线荧光（磷光）光谱曲线 固定激发光波长和强度，而让物质发出的荧光通过单色器测 定不同波长的荧光强度。以荧光的波长为横坐标，荧光强度 为纵坐标作图，便得发射光谱。 （图中蓝线或绿线）。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 200260320380440500560620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室

9、温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 3. 激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长 比激发光谱的长，振动弛豫消耗了部分能量。 b. 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如 能级图 2， 1），产生不同吸收带，但都是回到第一激发单 重态的最低振动能级再跃迁回基态，产生波长一定的荧光， 无论用无论用=250和和350nm作激发光源，所得发射光谱形状和峰的作激发光源，所得发射光谱形状和峰的 位置都是相同的。位置

10、都是相同的。 c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 21 3 外转换 2 T2 内转换 振动弛豫 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 200250300350400450500 荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 relatio

11、n between fluorescence and molecular structure 1. 分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有能吸收一定频率紫外光的特定结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 吸收的光量子数 发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有 关，如外转换过程速度快，则不出现荧光发射。 荧光量子产率（）： 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2. 化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光 （1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间窜跃过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移.

12、（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素 有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有给电子基团，使荧光 增强。卤原子取代会产生 重原子效应，荧光减弱。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 influenced factor of fluorescence 1. 溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化； 2. 温度的影响温度的影响 温度改变并不影响辐射过程，但非

13、辐射去活的效率将随 温度升高而增强，因此当温度升高时荧光强度通常会下降； 3. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 4. 内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光的物质，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 5. 荧光的熄灭（猝灭或淬灭）荧光的熄灭（猝灭或淬灭） 荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用，引起荧光强度降低的现

14、象称为荧光熄灭（猝 灭）。导致荧光熄灭的主要类型：碰撞熄灭、氧的 熄灭、自熄灭和自吸收等。 因此，在低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈 直线关系；当高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原 因，使荧光强度与分子浓度不呈线性关系。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 内容选择内容选择 第一节第一节 分子荧光和磷光分子荧光和磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 第二节第二节 分子荧光和磷光分析法分子荧光和磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 第三节第三节 化学发光分析化学

15、发光分析 chemiluminescence analysis 2021-8-8 分子 发光 分析j 课件 第十二章第十二章 分子发光分析法分子发光分析法 一、一、 仪器与结构流程仪器与结构流程 instrument and general process 二、二、 荧光分析法和应用荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、三、 磷光分析法的应用磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application 第二节第二节 分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法 molecular luminescen

16、ce analysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 一、仪器与结构流程一、仪器与结构流程 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由四个部分四个部分组成：激发光源、样品池、组成：激发光源、样品池、 双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 单色器单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色器 光源光源：高压汞灯、氙

17、弧灯 及染料激光器； 检测器检测器：光电倍增管。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 仪仪 器器 光光 路路 图图 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差（）和固定能量差及 可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱同步扫描技术可简化光谱，谱带变 窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如右图所示。 合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪氨酸 和色氨酸的荧光激发光谱相似，发 射光谱严重重叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征 光谱，实现分别测定。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件

18、可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法： （1 1）通常借助于荧光和磷）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。 （2 2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件

19、 二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application 1. 特点特点 （1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外可见分光光度法高24个数量级； 检测下限低：0.10.1g/L。 （2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱； （3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2. 定量依据与方法定量依据与方法 （1）定量依据）定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光吸收的光强强Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗伯比耳定律：由朗伯比耳定

20、律： Ia = I0(110- l c ) If = I0(110- l c ) = I0(1e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号内项近似处理后：浓度很低时，将括号内项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 （2）定量方法）定量方法 标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制 标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光 强度，在标准曲线上求出浓度。 比较法：比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 进行比较。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 3. 荧光分析法的应用荧光分析法的应用 （1）

21、无机化合物的分析）无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 （2）生物与有机化合物的分析）生物与有机化合物的分析 见下表 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and appl

22、ication 1. 稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法，快速灵敏测定稠环芳 烃和杂环化合物（致癌物质）；见下页表 2. 农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱等分析； 3. 药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见下页表 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 内容选择内容选择 第一节第一节 分子荧光和磷光分子荧光和磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 第二节第二节 分子荧光和磷光分析法分

23、子荧光和磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 第三节第三节 化学发光分析化学发光分析 chemiluminescence analysis 2021-8-8 分子 发光 分析j 课件 第十二章第十二章 分子发光分析法分子发光分析法 一、一、基本原理基本原理 Principle of CL 二、化学发光分析的特二、化学发光分析的特 点点 Characters of CL 三三 装置与技术装置与技术 instrument and technology of CL 第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法 molecul

24、ar luminescence analysis chemiluminescence analysis 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 一、基本原理一、基本原理 principle of CL 1. 化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从 激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A B = C * D C* C h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/m

25、ol；位于可见光区；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体（萤火虫、海洋发光生物）中， 称生物发光(bioluminescence)。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 2. 化学发光效率化学发光效率 化学效率：化学效率： emcecl 参加反应的分子数参加反应的分子数 发射光子的分子数发射光子的分子数 参加反应分子数参加反应分子数 激发态分子数激发态分子数 ce 发光效率：发光效率： 激发态分子数激发态分子数 产生光子数产生光子数 em 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： t c tI d d

26、A CLCL dc/dt 分析物参加反应的速率； 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 3. 化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物浓度相对于发光试剂小得 多，故发光试剂浓度可认为是常数，因此对于一级动力学反 应： dcA/dt =KcA； K 为反应速率常数。 ct t c ttIA tt CL 0 CL 0 CL d d d d 定量依据：定量依据： （1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性； （2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度（S），其与 被测物浓度成线性： 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 4. 化学发

27、光反应的类型化学发光反应的类型 （1）气相化学发光反应）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2*O2 NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3； b. 氧原子与氧原子与SO2的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3； 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 O3 O2 O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO O NO2* NO2 *

28、NO2 h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； d. 氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO O CO2* CO2 * CO2 h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； c. 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应： 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 （2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮一氧化氮和二氧化氮和二氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱

29、范围：发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：最大发射波长：690nm； 在在富氢火焰中：富氢火焰中： NO2 2H NO H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速； 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 b. 硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在在 富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 2H2 S 2H2O S S 2S2 * S2 * S2 h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：最大发射波长：394nm； 灵敏度：灵敏度： 0.2 ng/

30、cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 （3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、 Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程： 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这 一现象可测定这些金属离子。 2021-8-8 分子发光 分析j课 件 （1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用 这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、V4+ 、 Mn2+、Co2+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等 （2） 可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸