琼脂糖凝胶电泳法

1、微量移液器的使用 规格 1001000 L -蓝色吸头 20200 L-黄色吸头 10100 L-黄色吸头 0.510 L- 白色吸头 0.12.5 L- 白色吸头 微量移液器的使用简单结构卸枪头按钮握移液器手法一、标准操作适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。 1)按到第一档第一档，进入液面进入液面几毫米。 2)缓慢松开缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少。 3)打出液体时贴壁并有一定角度贴壁并有一定角度，先先按到第一档第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再再按到第二档第二档将剩余液体全部压出。微量移液器的使用二、注意事项1)吸液时：

2、应进入液面，慢吸慢放进入液面，慢吸慢放；若移液器倾斜，则移液不准确。2)装配吸头时： 应用力适当，选择匹配的吸头用力适当，选择匹配的吸头；若用力过猛，则吸头难以脱卸。3) 应选择合适量程范围合适量程范围的移液器；切忌用大量程的移液器移取小体积样品。4) 切忌切忌直接按到第二档吸液。5) 使用完后，应将移液器挂在移液器架上。6) 移液器吸头都已灭菌，吸液体时不碰任何其他东西，避免交叉污染。微量移液器的使用移液器使用视频 琼脂糖凝胶电泳法 分离鉴定分离鉴定核酸的常规方法 用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。 琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷不带电荷的中性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成

3、分为多糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结构。 DNA分子在电场中移动方向分子在电场中移动方向： 等电点等于pH22.5，在常规电泳缓冲液（pH8.5）中，带负电荷，在电场中向正极移动。带负电荷，在电场中向正极移动。 核酸分子在琼脂糖凝胶中的迁移率（核酸分子在琼脂糖凝胶中的迁移率（5个因素）：个因素）： （1） DNA的分子大小： 分子越大，迁移越慢分子越大，迁移越慢 （2） DNA分子的构象： 超螺旋环状线状超螺旋环状线状DNA切口环状切口环状 （3）琼脂糖浓度： 浓度越大越大，凝胶越硬越硬；较高浓度较高浓度的凝胶有利于有利于较小较小DNA片段片段的分离；较低浓度较低浓度的凝胶有利于有

4、利于较大较大DNA片段片段的分离。琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的 百分浓度（百分浓度（%） 线状线状DNA分子的分子的 有效范围（有效范围（Kb）0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1线状线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系（4）电源电压： 低低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比；成正比； 高高电压时，随着电压时，随着电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小有效分离范围缩小。 2 kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过不得超过5 V/cm8 V/cm。（5）离子强度

5、影响 在没有离子存在时（如误用蒸馏水误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动几乎不移动； 在高离子强度的缓冲液中（如误加10电泳缓冲液电泳缓冲液），则电导电导很高并明显产热很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 结果观察： 制备凝胶时先加入少量荧光染料荧光染料，其分子可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯紫外灯下直接观察到DNA片段片段在凝胶上的位置（荧光条（荧光条带），带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照。 器材电泳仪、水平电泳槽、梳子、微波炉、紫外灯 试剂 琼脂糖、1X TAE电泳缓冲液 、6x Loading buffer、荧光染料 琼脂糖凝胶制备及电泳过程琼脂糖凝胶制

6、备及电泳1、凝胶准备凝胶准备（0.8%）:用1TAE配制1琼脂糖凝胶。 称0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加100 mL 1TAE 微波炉加热大约大约1分钟分钟，熔化琼脂糖 熔化的琼脂糖自然冷却到自然冷却到6070，加入荧光染加入荧光染料料 2L，并轻轻混匀。2、倒胶倒胶： 将冷却60的凝胶缓慢倒入制胶模具倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子插上梳子。 室温下静置20 min，凝胶凝固凝胶凝固。拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极电场负极。3、点样：点样： 向电泳槽中加入加入1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液，让液面高于胶面1mm。 样品准备：吸取5 L已提取的基因组DNA点在点样纸上，加入1 L 6上样缓冲液上样缓冲液，用移液器轻轻混匀。上样：用移液器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。上样缓冲液（loading buffer）：可显示两条带，前面蓝色是溴酚蓝，代表300bp左右；后面浅绿是二甲苯青，代表约4000bp左右。功能：指示剂；沉降作用（含甘油），防止漂样。4、电泳、电泳： 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 。电泳条件：电压80v（恒压）；时间30 min左右（根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳） 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。5、紫外灯下观察并分析结果紫