hanyiwen-20140523修改

1、摘 要 细胞表面的多聚糖在许多至关重要的生理和生物过程中起着重要的作用，其中唾液酸（SA）在细胞表面的过表达已被公认为是恶性肿瘤的一个典型特征。凝集素是一种可以和糖类特异性结合的天然生物提取蛋白。具有特定亲和性凝集素的使用为靶细胞不同成长阶段多聚糖表达水平的检测提供了一种温和、非破坏性的定量分析方法。各种基于凝集素的检测方法中，电化学方法和生物传感器由于它们操作简便灵活、灵敏度高等特点，能够有效克服传统方法的局限性，因此得以被广泛研究应用。实验中我们设计以接骨木凝集素（SNA）、3-氨基苯硼酸（APBA）和辣根过氧化物酶（HRP）作为糖类识别和信号放大源来实现对细胞表面糖的定量分析。我们用化学

2、还原的氧化石墨烯和纳米金（rGO/PDDA/Au纳米复合物）作为凝集素固定的基底平台，以此构建生物传感器。然后，制备APBA修饰的碳球，在弱碱性的条件下，APBA基团能够与细胞表面的唾液酸作用而固定在细胞表面，同时APBA又可以与HRP上的甘露糖进行结合，从而将酶固定到碳球上。通过固定酶产生的电化学信号，希望能用于MCF-7（人乳腺癌细胞）的分析检测。关键词：凝集素；生物传感器；电化学方法；唾液酸2Abstract The sophisticated conformations of glycoproteins on cell surface play essential roles in a

3、 broad range of crucial physiological and biological processes, including growth, differentiation, cell-cell communication, cellular adhesion, immune response, disease and progression of cancer. The overproduction of sialic acid on glycan chains has been recognized as a characteristic feature of mal

4、ignant properties. Glycan assays based on lectin-glycan interactions have attracted much attention recently due to the relatively high efficiency of lectin arrays and the availability of diverse engineered natural lectins. The use of lectins with defined specificities offers alternative nondestructi

5、ve ways to profile glycan expression on cell surface at different developmental stages of diseases. Among the various lectin-based tools, lectin-based electrochemical strategies and carbohydrate biosensors have been studied extensively in complementing the limitation of conventional methods for cell

6、 surface glycan analysis owing to their operational simplicity, flexibility, and acceptable sensitivity. In our work, a biosensor for glycan assay on cell surface was constructed. Chemically reduced graphene oxide and gold nanoparticles (rGO/PDDA/Au nanocomposite) were used as the sensor platform fo

7、r lectin loading. Sambucus nigra agglutinin (SNA), a sialic acid binding protein was selected as a model. Then, a highly selective strategy integrating specific carbohydrates identification and enzymatic catalysis were developed for electrochemical detection of cell surface carbohydrates of MCF-7 by

8、 the combination of conjugated 3-amino-phenylboronic acid (APBA) on carbon nanospheres (CNSs-APBA NPs) by one-step hydrothermal synthesis, and horseradish peroxidase modified gold nanoparticles (Au-HRP NPs) as nanoprobes.Key words: Sambucus nigra lection; Biosensors; Electrochemical methods; Sialic

9、acid目录一、 研究背景与意义3二、前言4三、实验部分5 (一)rGO/PDDA/Au纳米复合材料的制备5 (二)碳纳米球（CNSs）的合成与CNSs-APBA的制备6 (三)Au-HRP纳米探针的制备6 (四)电化学生物传感器的制备6四、结果与讨论8 (一)电化学生物传感器的检测机理8 (二)CNSs-APBA及Au-HRP的表征9 (三)电化学生物传感器的表征10 (四)酶促反应催化产物的表征11五、结论12六、参考文献13七、致谢131、 研究背景与意义 细胞是生命体的基本单位,对细胞结构和功能的深入研究是人类征服疾病的关键。细胞表面多聚糖与许多重要的生物学过程都有密切的关系，如炎症、

10、胚胎发育、细胞信号传导、自体免疫激发等。值得注意的是，细胞表面多聚糖的异常变化与多种疾病特别是癌症相关。研究表明与癌症相关的糖类多位于细胞表面，因而这类糖的检测有望成为新的癌症诊断依据。近年来多种方法被用于多聚糖的检测，如质谱、核磁共振、色谱等。但这些方法需要昂贵的仪器、检测时间较长。因此，寻找灵敏度高、选择性好、操作简便的检测方法仍是人们努力的方向。 利用化学修饰电极进行电化学方法检测，是目前最为活跃的电分析化学的前沿领域之一，修饰电极应用到电化学分析具有分析速度快、操作简便易行、成本低、试剂用量少、检测灵敏度高、选择性好等优点，具有很大的实际应用性。修饰电极的一个重要应用就是利用修饰物质的

11、电催化活性来达到提高检测灵敏度和选择性的目的。对人体内多种生物活性小分子如多巴胺（DA）、抗坏血酸（AA）的电化学检测方法已趋于成熟，但目前对于一些复杂生物活性大分子的检测仍然具有很大的探索空间。因此，利用化学修饰电极来检测复杂生物活性大分子是具有极大科研价值和实际应用意义的。二、前言糖基化已经被证明是最常见、最结构多样化的真核细胞翻译后修饰作用之一。细胞表面糖蛋白复杂的构造在许多至关重要的生理和生物过程中起到了重要的作用，这些过程包括细胞的生长与分化、细胞间通信、细胞粘附、免疫反应、疾病以及癌症进程。细胞表面糖蛋白上多聚糖表达水平的变化已经被证实与许多的疾病相关，比如炎症，糖尿病，免疫缺陷等

12、，尤其是癌症。例如，唾液酸（SA）是一种具有九碳骨架的单糖，通常存在于糖链的终端位置。相比正常对照组，在结肠癌细胞表面发现了过量的唾液酸（SA）。唾液酸（SA）作为分子与细胞相互作用的重要监控器，它在细胞表面的过表达已被公认为是恶性肿瘤的一个典型特征。越来越多的证据表明：唾液酸（SA）表达水平的变化是与多种疾病密切相关的，比如心血管病、神经系统疾病和癌症。多年以来，许多研究人员旨在对复杂的糖基化机理有更进一步的理解，并且致力于研发低毒、有效的方法来测定细胞表面的糖类物质。目前可用的方法包括质谱分析法、色谱分析法、SA的原位化学修饰，以及通过叠氮化物代谢标记的生物正交反应来结合多聚糖类似物，可以

13、有效的用于多聚糖检测。然而，由于它们检测过程的复杂性，极高的细胞毒性和样品制备的破坏性，因此并不适合应用于活体细胞的原位多聚糖分析。与此相反，基于凝集素来识别细胞表面多聚糖的检测方法近来受到热捧，这是因为凝集素是一种可以和糖类特异性结合的天然生物提取蛋白。具有特定亲和性凝集素的使用为靶细胞不同成长阶段多聚糖表达水平的检测提供了一种温和、非破坏性的定量分析方法。在各种基于凝集素的检测方法中，电化学方法和生物传感器由于它们操作简便灵活、灵敏度高等特点，能够有效克服以上传统方法的局限性，因此得以被广泛研究应用。各种基于凝集素具有纳米结构的电极界面，比如导电高分子聚合物、碳纳米管和纳米金已经被合成用于

14、细胞的高灵敏测定。近年来，苯硼酸（PBA）作为一种特殊的糖敏感性合成小分子，引起了人们的极大兴趣。PBA及其衍生物一方面可以长时间存储；另一方面，与生物蛋白凝集素相比，PBA及其衍生物具有更好的生物稳定性，而前者由于是生物分子，容易发生变性。已经有文献报导，在弱碱性条件下，顺式二醇与苯硼酸之间有特殊的相互作用，二者会形成一个五环或六环的环酯。因此，PBA及其衍生物可以与含有1,2 或1,3顺式二醇结构的糖（例如半乳糖和甘露糖）形成稳定的复合物。最近有研究证明，PBA与SA的结合方式与其他糖类的相比，有极大差异性。在pH为7.4的生理条件下，SA可以与中性的PBA形成稳定的复合物。更有详细的研究

15、工作计算了在pH为7.4的磷酸缓冲液中，PBA与不同糖类之间结合常数。结果表明PBA与SA的结合常数要远远高于与其他糖类的结合常数。通过实验发现了对糖类亲和力的选择性趋势依次是： SA 半乳糖 甘露糖 葡萄糖 。基于PBA这些特性，借助活体细胞成像技术，近来，利用PBA功能化的量子点已经被用于实际样品中的葡萄糖以及细胞表面的唾液酸（SA）的检测。因此，基于PBA构建的纳米材料在活体细胞糖蛋白或多聚糖检测上展现出了很好的应用前景。借鉴之前的工作，本实验的目的是发展识别特定糖类的多功能纳米探针以及酶催化方法，通过生物界面的耦合来进行细胞表面糖类的电化学检测。实验中我们分别以接骨木凝集素（SNA）、

16、3-氨基苯硼酸（APBA）和辣根过氧化物酶（HRP）作为糖类识别和信号放大源来实现对细胞表面糖的定量分析，我们用化学还原的氧化石墨烯和纳米金（rGO/PDDA/Au纳米复合物）作为肿瘤细胞固载的传感器基底平台，以此构建生物传感器。rGO/PDDA/Au纳米复合物不仅具有良好的导电性，还具有良好的机械稳定性和生物相容性。因此rGO/PDDA/Au纳米复合物可以为SNA的连接提供一个良好的识别界面，并可以显著提升细胞的捕捉效率和生物传感器对细胞表面糖的敏感性。然后，制备APBA修饰的碳球，在弱碱性的条件下，APBA基团能够与细胞表面的唾液酸作用而固定在细胞表面，同时APBA又可以与HRP上的甘露糖

17、进行结合，从而将酶固定到碳球上。通过固定酶产生的电化学信号，希望能用于MCF-7（人乳腺癌细胞）的分析检测。三、实验部分(一)rGO/PDDA/Au纳米复合材料的制备 氧化石墨烯购于南京吉仓纳米科技有限公司。参照以前的文献，将石墨烯与水合肼混合，用化学还原的方法合成rGO/PDDA纳米复合材料。首先，将10mg石墨烯溶到50ml水中，超声直至分散均匀，再注入0.25 ml PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵）搅拌1h。然后将GO/PDDA 纳米材料与0.5ml水合肼进一步混匀，90反应过夜。随后，将黑色的rGO/PDDA清洗数次，放入干燥箱中烘干。最后，取上述产物配成2mg/ml的溶液，将5ml

18、直径为13nm的Au纳米粒子（用经典柠檬酸钠还原法制备）加到1ml上述溶液中，超声30min。将所得产物离心清洗3次之后，得到rGO/PDDA/Au纳米复合材料，并分散到1ml水中，4保存。(二)碳纳米球（CNSs）的合成与CNSs-APBA的制备 碳纳米球是由葡萄糖水热法合成的。首先将4g葡萄糖溶解于40ml水中，将所得溶液加入到一个50ml的反应釜中，在反应前，通氩气10min去除溶液中的氧气。接着，将溶液加热到200，在该温度下反应6h。将所得的产物在12000转/min的转速下离心10min，从中分离得到黑色产物。然后将其分散到乙醇中再次进行离心，将上述过程循环三次。最后，将所得产品烘

19、干保存。 在对碳纳米球进行修饰之前，我们需要将碳纳米球羧基化。做法是将浓硝酸、浓硫酸和水以体积比1:3:6配成溶液，向上述溶液中加入10 mg碳纳米微球，并在常温下超声4 h，之后将羧基化的碳纳米微球用水清洗至上层清液呈中性。在12000转/min的转速下离心10 min后，将羧基化的碳纳米微球溶于1 ml含有100 mM NHS（N-羟基琥珀酰亚胺 ）和 400 mM EDC （1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）的溶液中，并在pH为 5.2的MES（2-N-吗啉代乙磺酸水合物）缓冲液中搅拌活化30min。将所得溶液离心清洗，溶于1 ml pH 为7.4 的PBS（磷酸缓冲液）

20、中得到均匀的溶液。最终将上述羧基化的C球分散液与浓度为1 mg/ml的APBA（3-氨基苯硼酸）混合，振荡4 h。反应后的混合物用PBS清洗，并在12000转/min的转速下离心10min，分散至1 ml pH 为7.4 的PBS中，4保存。(三)Au-HRP纳米探针的制备Au纳米粒子采用经典的柠檬酸钠还原法制备。在进行修饰HRP之前，用浓度为10 mM的K2CO3溶液将2ml 纳米金溶液的pH调到9.0，然后将4 mgHRP（辣根过氧化酶）加到溶液中，并在常温下搅拌1 h。将所得的溶液在12000转/min的转速下离心15 min，从而分离得到Au-HRP纳米探针，再其重新分散到1.0 mL

21、 浓度为10mM 的PBS溶液中（pH 8.0），并置于冰箱中4保存。(四)电化学生物传感器的制备在进行电极修饰之前，首先将玻碳电极用氧化铝粉末抛光至镜面，然后依次在丙酮、硝酸、氢氧化钠、水中超声。然后，将10 µL之前准备好的rGO/PDDA/Au纳米复合材料滴涂到干净的玻碳电极表面，并在红外灯下烘干。之后将制得的rGO/PDDA/Au纳米复合材料修饰的玻碳电极浸入含有25mM巯基乙酸乙醇溶液中并在4培育24h。将电极用PBS溶液清洗，并用氩气吹干。随后，将10µL含有100 mM的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和400 mM 的EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二

22、亚胺盐酸盐）的溶液滴涂到生物传感器表面，在常温下放置30 min以此来活化巯基乙酸的羧基部分。用BSA（牛血清蛋白）封闭非特异性结合位点后，再在生物传感器表面滴涂10 µL 1.0 mg/ml SNA（接骨木凝集素）培养50 min。再将初步制备的生物传感器置于4保存。四、结果与讨论 (一)电化学生物传感器的检测机理细胞表面唾液酸表达水平的检测原理如原理图1所示。首先将氧化石墨烯/PDDA/纳米金(rGO/PDDA/Au)纳米复合物滴涂到玻碳电极表面（GCE）并在红外灯下烘干，由于氧化石墨烯/PDDA/纳米金(rGO/PDDA/Au)复合物具有优良的导电性、极大的比表面积和良好的生物

23、相容性，它可以显著提高电极界面的电子转移速率，为SNA（接骨木凝集素）的固定提供足够的位点。通过SNA和癌细胞表面唾液酸之间的特异性识别作用，电极界面可以捕获不同浓度的癌细胞。SA可以与中性的PBA形成稳定的复合物。因此，利用APBA可以在生理条件下识别唾液酸的特性，将准备好的CNSs-APBA纳米粒子和捕获的癌细胞进行孵育，形成一个“三明治”夹心式体系。在此之后，在pH为8.0的条件下，依靠APBA与HRP糖蛋白上甘露糖之间的亲和力，将Au-HRP纳米探针固定到 CNSs-APBA纳米粒子上。最后，在催化液中，HRP可以在电极表面催化苯胺生成电活性物质聚苯胺（PAn）。夹心反应利用了SNA和

24、CNSs-APBA纳米粒子来捕获细胞和HRP标签的固定，以此实现细胞表面唾液酸的定量分析。同时，CNSs-APBA纳米粒子可以有效负载大量的APBA分子和 HRP探针，因此可以提高催化产物聚苯胺的响应电流，从而提高生物传感器的选择性和灵敏度。图1 细胞表面唾液酸表达水平的检测原理FIG.1 Detection mechanism of sialic acid expression on cell surface(二)CNSs-APBA以及Au-HRP的表征我们利用SEM（扫描电子显微镜）来表征了水热法合成的碳纳米球，如图2所示，碳球直径大约在100-200 nm 左右。与传统的高分子聚合物或者

25、二氧化硅微球合成方法相比，该合成方法具有两大特点：1，该方法是一种“绿色无污染”的合成方法；2，与其他纳米结构的合成相比，该方法的合成过程没有用到任何有机试剂、引发剂、表面活性剂等，确保了其在实际应用中良好的生物相容性和稳定性。图2 碳纳米球的扫描电镜图FIG.2 SEM image of carbon nanospheres为了确定C纳米球上结合的APBA数目，我们测定了产物上清液在波长232nm（APBA紫外特征吸收峰）处的最大紫外特征吸收峰，通过标准曲线法来确定产物上清液中未反应的APBA（图3）。根据反应的羧基化C纳米球的质量和尺寸，反应的APBA的物质的量，我们可以得出每个C纳米球上

26、的APBA平均个数约为4.2×108个。(b)(a)图3 （上图）APBA紫外特征吸收，（下图）APBA紫外吸收标准曲线（232nm）及上清液APBA含量(注：标准曲线APBA浓度 0.01mmol-0.2mmol)FIG.3 (a) The absorbance spectra of APBA, (b) The calibration curve of APBA.同时，我们还对合成的Au-HRP纳米探针进行了紫外表征，如图4所示，曲线a是纳米金的紫外可见吸收图谱，其在520nm处是纳米金的特征吸收峰。曲线b是HRP的吸收光谱，从图中可以看出，在403nm处和280nm处分别是其辅基

27、和酶蛋白的特征吸收峰。曲线c中纳米金和HRP的特征吸收峰都明显存在，可证明HRP已被成功修饰到纳米金的表面。图4 紫外可见图谱 a: AuNPS b:HRP c:Au-HRPFIG.4 The UV-vis spectra of AuNPS (a), HRP (b), Au-HRP(c).(三)电化学生物传感器的表征rGO/PDDA/Au纳米复合物拥有很大的比表面积，优良的导电性、溶解性和生物相容性，它可以有效保持生物活性以及提高生物蛋白的负荷量。我们分别对比了几种不同的基底对于修饰电极的影响，包括纳米金/玻碳电极(Au/GCE)、氧化石墨烯/PDDA/玻碳电极(rGO/PDDA/GCE)、氧

28、化石墨烯/PDDA/纳米金/玻碳电极(rGO/PDDA/Au/GCE)。通过观察基于不同基底的生物传感器的CV响应（图5），我们可以发现，在rGO/PDDA/Au/GCE这种基底上获得了最强的电流信号。这可以归结于纳米金和rGO/PDDA两者的协同改进作用。实验结果表明，用氧化石墨烯/PDDA/纳米金(rGO/PDDA/Au)修饰的玻碳电极作为基底制备生物传感器能够有效提高灵敏度，并且能降低检测限。图5 扫描采用不同的基底，包括（a）裸玻碳电极，（b）纳米金/玻碳电极，（c）氧化石墨烯/PDDA/玻碳电极，（d）氧化石墨烯/PDDA/纳米金/玻碳电极修饰的生物传感器所得的循环伏安图。 FIG.

29、5 the CVs on the biosensors with different substates,including (a)GCE,(b)Au/GCE,(c)rGO/PDDA/GCE,(d)rGO/PDDA/Au/GCE.(四)酶促反应催化产物的表征为了证明成功得到了催化产物聚苯胺（PAn），用循环伏安法在pH为4.3的醋酸缓冲液中对生物传感器的电化学行为进行了CV扫描。从图6中可以看出，在酶促反应之前，是看不到氧化还原峰的。然而在酶促反应之后，可以观察到一对显著的氧化还原峰。此外，我们用红外光谱也对酶促反应的产物进行了表征。如图所示，在酶催化反应之后，我们可以观察到一个醌型吸收峰（波

30、数为1550 cm-1, 1120 cm-1处）和一个很强的苯型吸收峰（波数为1492 cm-1, 801cm-1处），这与之前的文献报导是一致的，进一步确定了在生物传感器表面成功得到了聚苯胺（PAn）催化产物。图6 酶促反应产物的红外光谱图。 FIG.6 FT-IR spectroscopy of the enzymatic reaction product. 五、结论测定细胞表面的糖类物质传统方法有质谱分析法、色谱分析法、SA的原位化学修饰，以及通过叠氮化物代谢标记的生物正交反应来结合多聚糖类似物等。然而由于它们检测过程的复杂性，极高的细胞毒性和样品制备的破坏性，因此并不适合应用于活体细胞

31、的原位多聚糖分析。本实验中，具有特定亲和性凝集素的使用为靶细胞不同成长阶段多聚糖表达水平的检测提供了一种温和、非破坏性的定量分析方法。在各种基于凝集素的检测方法中，电化学方法和生物传感器由于它们操作简便灵活、灵敏度高等特点，能够有效克服以上传统方法的局限性。本实验还利用APBA设计了一种识别糖类的分子识别器，分别来与细胞表面的唾液酸和HRP上的甘露糖来进行结合，以此来构建电化学生物传感器。首先，完成了CNSs-APBA纳米复合物的制备，并用扫描电镜对碳球进行了表征，碳球直径大约在150-200 nm 左右。通过对比了几种不同的基底对于修饰电极的影响，发行在rGO/PDDA/Au/GCE这种基底上获得了最强的电流信号，确定了用rGO/PDDA/Au修饰的玻碳电极作为基底制备生物传感器，能够有效提高灵敏度，并且能降低检测限。将酶促反应产物用红外光谱进行表征，证明在生物传感器表面成功得到了聚苯胺（PAn）催化产物。接下来，我将对电化