细胞工程学习题及答案

1、细胞工程学习题及答案细胞工程学习题及答案一、名词解释细胞工程:细胞工程是指以细胞为对象，应用生命科学理论和技术，借助工程学原理，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织、新型物种及对人类有用的产品的一门综合性科学技术。 接触抑制:当两个细胞由于移动而互相靠近发生接触时，细胞不再运动，这种由细胞接触而抑制细胞运动的现象称接触抑制，是某些贴附型细胞生长特性之一。密度抑制:细胞发生接触抑制，但只要营养充分，仍能增殖分裂。但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，导致分裂停止，发生密度抑制现象。原代培养:原代培养也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持

2、续1-4周。原代培养的细胞称原代细胞。传代培养:指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。细胞系:原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。细胞转化:指细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，这种变化可代代相传，致使细胞的一系列生物学特性、生长特点都随之发生改变。细胞转化分为一般转化和恶性转化两种方式。固定化培养:是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。微载体:是直径60-250m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。分批式培养:分批式培养是指先将细胞和

3、培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养，一次性收获细胞和产物。灌注式培养:灌注式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。细胞融合:细胞融合是指两个或两个以上来源相同或不同的细胞合并成一个细胞的过程。分为：自发细胞融合&人工诱导细胞融合克隆化培养:克隆化培养是指使单个杂交细胞在一个独立空间中生长增殖，最终扩展成一群相对较纯的、能够稳定表达某些特定性状的细胞群体的

4、培养方式。抗原决定簇:抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。由于抗原决定簇通常位于细胞表面，因此又称为抗原表位。互补决定区（CDR）:指可变区VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，又称高变区（HVR）。杂交瘤技术:又称单克隆抗体制备技术，指将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌单一抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞的技术。该技术的基础是细胞融合技术，最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。酶联免疫吸附法（ELISA）:在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按

5、不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。人改型抗体（CDR移植抗体）:利用基因工程技术，克隆出鼠源单抗CDR序列，置换人抗体中的CDR序列。这种“重构型抗体”在人体内的免疫性大为降低，因其主要涉及CDR的“移植”，又称为“CDR移植抗体”。胚胎工程:指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎体外培养等，以加速繁育经济动物，培育优良品种，挽救濒危动物。精子获能:即精子在雌性动物生殖道内发生生理变化后，获

6、得穿透卵子的透明带能力的过程。顶体反应:精子释放顶体酶熔蚀放射冠和透明带的过程。超排: 以各种外源性促性腺激素诱发动物卵巢有更多的卵泡发育，并排出更多的具有受精能力的卵子。试管动物:是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。饲养细胞:将胚胎与某些类型的体细胞共同培养可以有效地克服发育阻滞，这些与胚胎共同培养的细胞称为饲养层细胞。饲养层细胞一方面提供物理支持；另一方面通过合成和分泌促分裂因子和分化抑制因子，促进细胞增殖和抑制细胞分化。核移植技术:指利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。动物克隆技术:

7、指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的胚胎生物技术。哺乳动物的克隆技术包括胚胎克隆和体细胞克隆两种。ES细胞:指源于囊胚内细胞团（inner cell mass,ICM）的胚胎干细胞。这是获得胚胎干细胞的主要途径。ES细胞一般是指该途径分离到的胚胎干细胞。iPS细胞: iPS cell指将体细胞经过基因改造转化为具有多向分化潜能和自我更新能力的人造干细胞。是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的体细胞。 细胞治疗:指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向。

8、组织工程:将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖和分化，然后移植到人体所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一门技术。 胶原:胶原是目前使用得最多的一类天然支架材料，是人体含量最多的蛋白质，占人体蛋白30以上，为胞外基质中含量最高的水不溶性纤维蛋白，参与形成结缔组织（皮肤、肌腱、骨骼、软骨、韧带），具有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其他基质分子相互作用达到组织需要的强度、弹性。 转基因动物:指基因组中稳定整合有人工导入外源基因，并且外源基因可以在其体内表达并稳定地遗传给后代的基因工程的动物。 植物组织培养:将植物外植体材料无菌条件下培养在人工培养基

9、上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。 外植体:由活体植物体上取下来的、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（即被培养部分）营养繁殖:是植物繁殖方式的一种，不通过有性途径，而是利用营养器官如枝、根、茎、叶等繁殖后代。营养繁殖属于无性繁殖。 植物细胞的全能性:从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。 脱分化:分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。 体细胞胚:又叫胚状体，指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物，可以发育成正常可育的植株。玻璃化现象:植物组织培养中，常

10、会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化现象，又称过度水化现象。人工种子:又称合成种子或体细胞种子，指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。植物脱毒: 通过一定方法除去植物体内病毒的技术。远缘杂交: 指不同种间、属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交。经常与化学与物理方法结合使用。花粉培养: 将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。看护培养:将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。细胞悬浮培养: 非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养

11、基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以了。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。诱导子: 是一类特殊的触发因子，它能够开启代谢过程中酶的活性，因而能够增加次生代谢物的含量，有时甚至可以诱导出新的化合物。诱导子是来自生物的化合物。内生诱导子：来自植物细胞分子。两相培养: 两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相;细胞在水相中生长，合成的次

12、生代谢物质分泌出来后转移至有机相中。二、问答题1、简述细胞工程的研究内容。细胞工程涉及的范围很广，按实验操作对象和技术分：（1）细胞培养和组织培养；（2）细胞融合；（3）细胞核移植；（4）染色体工程；（5）胚胎工程；（6）干细胞和组织工程；（7）转基因生物和和生物反应器。2、分别举一例说明细胞工程在疾病的治疗和农业上的应用。【（1）2007年，日本医学家，诱导多功能干细胞(iPScell)创始人之一，山中伸弥所在的研究团队通过对小鼠的实验，发现诱导表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗目前多种心血管疾病提供了巨大助力。这一研究成果在全世

13、界被广泛应用，因为其免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约。（2）人工种子指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。人工种子可快速繁殖植物；便于运输和储藏（相对于试管苗）；人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子；与普通试管苗相比，人工种子成本低，更适合机械化田间播种。】3、细胞工程实验室的基本要求？动物细胞工程实验室必备的主要设备？基本要求：具备无菌操作和无菌培养的环境条件。【无菌操作设备：净化工作台或生物安全柜、无菌接种箱灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、鼓风干燥箱、过滤

14、灭菌装置细胞培养设备： CO2培养箱、生物反应器细胞学设备：倒置显微镜（基本）、显微操作系统、流式细胞仪基本设备：纯水设备、离心机、液氮罐等】4、简述玻璃器皿的清洗过程。玻璃器皿的洗涤：步骤：（1）浸泡（清水或5%稀盐酸浸泡过夜）；（2）刷洗（洗涤剂）；（3）浸酸（强酸清洗液）；（4）冲洗（清水-蒸馏水）。5、高压蒸汽灭菌器使用注意事项？（1）灭菌器内物品的放置总量不应超过灭菌器柜室容积的85%。各包之间留有空隙，以便于蒸汽流通；（2）灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空；（3）灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归“0”位后才可打开盖或门。6、影响紫外线杀菌效果的因素有哪些？·一般用于灭菌

15、的紫外线波长是200-300nm，灭菌力最强的是波长为254nm的紫外线。·穿透作用微弱，所以紫外线常用作空气灭菌和表面灭菌。·紫外线进行直线传播，其强度与距离平方成比例地减弱。·湿度过大可降低灭菌效果，相对湿度以45-60比较适宜。温度宜于10-55范围。·紫外线灯管必须保证无尘油垢，否则辐射强度将大力为降低。·紫外线灯有一定的有效使用时间，一般为3000小时。·紫外线的杀菌效率，还取决于微生物的敏感性。一般杀死繁殖型微生物约3-5分钟，芽孢约10分钟。紫外线对酵母、尤其霉菌杀菌力较弱。7、化学消毒剂的杀菌机制？影响消毒剂消毒灭菌效

16、果的因素？·化学消毒剂的杀菌机制：（1）使菌体蛋白变性或凝固；（2）干扰微生物的酶系统和代谢；（3）损伤细胞膜，改变细胞膜壁的通透性。·影响消毒剂消毒灭菌效果的因素：（1）消毒剂的性质、浓度和作用时间；（2）细菌的种类与数量；（3）环境因素（有机物如血清等存在，会结合消毒剂，减低杀菌效果）。8、无菌操作室如何消毒？·地面每天都要用0.1%的新洁尔灭或2%-5%的来苏尔拖洗（拖布专用）·空气每天紫外灯照射消毒30-50min，并定期应用环氧乙烷、甲醛、丙二醇或乳酸等对空气进行较彻底的灭菌。·操净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗，然后紫外线消

17、毒30min（培养细胞和培养用液切勿受到紫外线照射）。在关闭灭菌灯后应启动送风机使之运转数分钟后再进行细胞操作。9、简述动物细胞培养的一般过程。取材、分离细胞：【用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗至组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。】¯原代培养：【（1）组织块直接培养法（2）酶解消化法】¯传代培养：【方法：（1）悬浮生长的细胞：直接分瓶（离心收集胞体、新鲜培养基稀释、转移新培养瓶）（2）贴壁生长的细胞：需经酶消化后才能分瓶】¯冻存、复苏：【冻存：· 冷冻过程要缓慢&

18、#183; 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。· 细胞浓度控制在：5x1062x107/ml。快速解冻：冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化】10、为什么血清是动物细胞培养基中最有效和最常用的组分？血清对维持体外细胞生长具有极为重要的作用：（1） 提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物等；（2） 提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等；（3） 提供结合蛋白（载体蛋白）：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如

19、白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用；（4）提供促接触和伸展因子：如纤粘连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）,促使细胞贴壁；（5）可中和毒性物质保护细胞：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用；（6）血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。11、动物细胞体外培养的生长条件（温度、PH、气体）？环境无毒和无菌温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为为3537。pH：哺乳动物细胞为7.2-7.4。气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2。

20、常使用二氧化碳培养箱，一般制在5% CO2 和95% 空气。12、MTT法检测细胞活力原理？活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲暨颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。13、细胞培养过程中清除支原体污染的方法有哪些？·支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法每4天换一次液，连续处理15天。·清洗纯化法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。如结合敏感抗生素的抑杀作用

21、，可达到更好的效果。·药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。·支原体特异性血清法用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。14、动物细胞大规模培养的方法主要有哪些？各有何优缺点？（1）转瓶（管）培养：转瓶培养是在转管培养基础上为扩大培养量而改进的，一般用于小量培养和大规模培养的过渡阶段。·优点：细胞接种贴附在转瓶的内表面，培养过程转瓶不断旋转，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气

22、体交换。·缺点：单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低。（2）固定化培养：是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。·优点：细胞生长密度高（将载体与生物反应器相结合，既满足动物细胞贴壁要求，有可以利用生物反应器内部空间），并可以实现悬浮培养。抗剪切力和抗污染能力强。15、为什么微载体培养系统是目前最有发展前途的一种培养模式？该模式把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。（1）比表面积大；（2）生物相容性好：无毒无害，有好的黏附性，一般带正电荷；（3）机械性能强：可搅拌，能保护细胞，重复利用；（4）微载体悬浮于培养基

23、中，细胞生长环境均一，便于检测和控制；（5）培养基利用率高；（6）放大较容易；（7）热稳定性好：适合高压灭菌。16、细胞培养的操作方式有哪些？各有何特点？（1）分批式培养定义：分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养，一次性收获细胞和产物。特点：细胞所处的生长环境随着营养物的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化。分批培养过程反应体积不变。（2）流加式培养定义：流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞持续生长至较

24、高的密度，目标产物达到较高水平。特点：能够调节培养环境中营养物质浓度。流加式培养过程反应体积是变化的。（3）半连续式培养定义：半连续式培养又可称为反复分批式培养，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。特点：反应器内培养液的总体积不变，培养物体积逐步增加，细胞可持续指数增长，可保持产物和细胞在较高浓度水平，培养过程可延续较长时间，可进行多次回收。（4）连续式培养定义：连续式培养是将细胞接种于一定体积的培养基后，为防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度前，以一定速度向反应器内连续添加新鲜的培养液，同时以等

25、速度连续从反应器流出细胞培养物，使反应条件处于一种恒定状态。特点：是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器。反应器的培养状态长时间稳定，使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的生长和产物的形成。由于连续式培养过程中连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产上被应用于培养非贴壁依赖性细胞。（5）灌注式培养定义：灌注式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。·灌注式培养的优点：（1）细胞截留系统可使细胞保留在反应

26、器中，维持较高的细胞密度；（2）连续灌流系统，使细胞稳定地处在较好的环境中，有害代谢废物浓度积累较低；（3）反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产物回收率高；（4）产品在罐内停留时间短，可及时回收至低温保存，有利于保持产品活性。·缺点：该方法最大困难是污染概率较高。17、人工诱导细胞融合的方法有哪些？各有何优缺点？（1）生物方法病毒诱导融合特点：毒力低、危害小, 易被紫外线灭活, 融合效率相对较高，故被广泛采用。（2）化学方法诱导融合优点：融合成本低，用法简单，融合子产生异核率高，融合效果稳定；缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。（3）电诱导融合（简称电融合）&

27、#183;电融合法的优点：适用范围广泛； 不需加外源因子；对细胞的毒性相对低； 融合率很高，可达50%80%；可用于细胞数量很少的融合过程；可在显微镜直视下定向诱导细胞融合以及直接挑选杂交细胞。·电融合法的缺点：需专用的融合设备； 易产生同源细胞融合； 在融合膜成分十分不同的细胞时也存在困难；融合大小不同的细胞时易出现问题，细胞直径愈小，所需的电脉冲量愈大，大型细胞易因电场太强而导致死亡。18、简述克隆化培养的有限稀释法。·首先将阳性细胞进行计数，用培养基进行梯度稀释后加入微孔培养板（96孔板，事先制备好饲养层细胞）内，使孔内落入细胞的几率为每孔一个细胞；·培养一

28、段时间后，可观察到部分孔内有单个克隆生长，进行检测；·根据检测的阳性结果再进行克隆化。19、细胞融合技术可应用于哪些研究领域中？（一）基因定位（二）细胞分化的表达调控研究（三）遗传基因的缺陷互补研究（四）淋巴细胞杂交瘤（五）体细胞杂种的致瘤性分析（六）制作疫苗（七）核移植和克隆动物20、抗体的研究三个层次？（1）整体水平抗体生成技术（多克隆抗体（抗血清）；（2）细胞工程抗体生成技术（单克隆抗体）；（3）基因工程抗体生成技术（嵌合抗体、改形抗体；“小型化抗体” （单链抗体）；噬菌体抗体库技术；Ig基因转基因小鼠；抗体真核表达技术）。21、简述单克隆抗体的制备过程及其主要原理。（1）动物

29、免疫与免疫脾细胞悬液的制备（2）骨髓瘤细胞的获得与培养（3）细胞融合（4）杂合细胞筛选-正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，会自行死亡；-骨髓瘤细胞是HGPRT与TK缺陷型，在HAT选择培养基中不能正常生长；-只有具有亲代双方遗传性能的杂交瘤细胞，可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。（5）杂交瘤细胞克隆化培养（6）分泌抗体的杂交瘤细胞筛选（7）单克隆抗体的大量生产22、HAT的选择原理是什么？筛选原理：DNA的合成：·正常途径：可以被氨基蝶呤阻断糖、氨基酸核苷酸DNA·补救途径：需要2种酶的参与胸腺嘧啶核苷激酶（TK）&

30、;次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）核苷酸前体核苷酸DNA23、何谓噬菌体抗体库(surface display antibody library)技术？将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌，使外源抗体基因表达并展示于噬菌体表面，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。24、简述胚胎移植主要技术程序。（1）供体和受体的选择；（2）受体同期发情处理；（3）超数排卵处理；（4）供体母畜的配种；（5）胚胎的收集；（6）胚胎的检查；（7）胚胎的保存与培养；（8）胚胎的移植；（9

31、）体内发育、出生。25、试管动物培育流程。（1）超数排卵、卵子采集与成熟培养；（2）精子采集与体外获能；（3）体外受精；（4）胚胎体外培养；（5）胚胎移植；（6）体内发育、出生。诱发超排、体外受精和胚胎移植三项是关键技术。26、什么叫发育阻滞？如何克服？指体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育的现象。目前克服发育阻滞现象的采用的主要方法：（1）改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需的物质成分；（2）利用辅助细胞或饲养细胞共培养（co-culture）体系。目前广泛采用的有：输卵管上皮细胞共培养体系和颗粒细胞单层共培养体系，在体外与受精卵共同培养，对早期胚胎

32、发育有明显促进作用。27、核移植技术流程。（1）核供体细胞的准备；（2）受体细胞的去核；（3）细胞核移植、激活；（4）重组胚的培养与移植；（5）核移植后代的鉴定。28、简述流式细胞仪分离X、Y精子的原理。· X和Y精子DNA含量存在差异（X>Y）；· 荧光染料HOECHST 33342着色差异；· 激光照射后荧光信号差异（X强于Y）；· 荧光信号通过分离仪信息芯片处理；· 含X/Y精子的液滴通过高压磁场处理；· 携带不同电荷的液滴在电场作用力的引导下，落入左右两旁的收集容器中，X精子和Y精子得以分离。29、什么是干细胞？两个最为

33、显著的特征？有哪些主要类型？干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。两个最为显著的特征：能够自我更新和具有分化潜能主要类型：根据细胞所处的发育阶段：胚胎干细胞、成体干细胞。根据干细胞的发育潜能：全能干细胞、 多能干细胞、单能干细胞（专能干细胞）。30、简述在机体内干细胞的增殖特性及其意义。（1）干细胞增殖的缓慢性缓慢增殖的意义：·可以减少基因发生突变的危险，且使干细胞有更多时间发现和校正复制错误。·利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序；（2）干细胞增殖系统具有很强的自稳定性干细胞可以在生命时段的某个区间中自我更新，并维持其自身数目恒定

34、，这是干细胞的基本特征之一。31、简述ES细胞建系的主要操作步骤和方法。（1）与饲养层共培养法一般采用丝裂霉素C或射线处理饲养层细胞，阻断有丝分裂，保持细胞活力但不增殖，处理后接种到预先用明胶包被的培养板孔内，形成饲养单层细胞。（2）无饲养层培养法利用在基础培养基中添加一定比例的分化抑制因子、生长因子等成分制备的条件培养基培养胚胎干细胞。保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。32、如何鉴定ES细胞以及评价其的分化潜能？ES细胞的鉴别特征：·ES细胞形态学鉴定依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）

35、对ES细胞进行初步鉴定。·核型分析ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验。·碱性磷酸酶（AKP）染色用固蓝KR或其B盐溶于萘酚AS-TR中，染色未分化的干细胞,呈棕红色或蓝色。·具有转录因子Oct-4的表达Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。胚胎干细胞分化潜能评价：·体外分化试验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，则贴壁生长的ES细胞会自发地分化为各种细胞，而悬浮生长的ES细胞会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状胚体。·体内分化试验：将一定量培养的ES细胞注入同源动物的皮下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织瘤内有三个胚层

36、的细胞存在。·核移植检测：将培养的细胞作为核供体注入去核卵母细胞中，观察重构胚是否正常发育。·嵌合体形成检测：将培养的细胞与受体胚胎结合并移植入同期假孕受体，ES细胞可参与受体胚胎的发育从而得到嵌合体动物，然后通过毛色判断，或同工酶检测。33、简述造血干细胞在细胞治疗方面的应用。-血液病的细胞治疗：如白血病的细胞治疗造血干细胞移植（自体移植、同系移植、同种移植）造血干细胞移植的应用：1）替代治疗2）大剂量放化疗后的支持治疗（用大剂量放化疗治疗肿瘤时，联合造血干细胞移植）3）免疫治疗4）基因治疗（将免疫调节分子基因、抑癌基因等导入造血干细胞，再将其回输体内进行基因治疗）34、

37、试从来源、获得手段、分化潜能、对干细胞研究的意义等方面比较ES细胞和iPS细胞。ES细胞iPS细胞来源1.直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法2.核移植后培养的囊胚3.采用体外受精培养的早期胚胎分离胚胎干细胞体细胞经过基因改造转化得到的具有多向分化潜能和自我更新能力的人造干细胞获得手段1） 免疫外科学方法2） 显微外科学方法3） 组织培养法细胞核重编程分化潜能全能干细胞多能干细胞意义1.细胞治疗2.动物克隆及人类治疗性克隆3.ES作为外源基因载体生产转基因动物个体即嵌合体。4.制备嵌合体动物“iPS cell”具有和胚胎干细胞类似的功能，使得人们不必破坏胚胎获取干细胞，这绕开了胚胎干细胞研

38、究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。35、组织工程三个基本要素？（1）种子细胞（2）支架材料（3）细胞因子36、理想的支架材料应具备的特点？（1）良好的生物相容性；（2）良好的可降解，其降解产物对人体无害；（3）良好的可塑性和一定机械强度；（4）具有三维立体多孔结构和较大的比表面积；（5） 良好的材料-细胞界面：利于细胞粘附、生长、分化；（6）具有引导或诱导组织再生的能力。37、组织工程有哪三条技术路线？其中哪条途径是组织工程研究的主要内容，以人造皮肤的制作为例说明之。第三条途径是组织工程主要的研究内容。前两条途径是以实现原位修复为目的，第三条途径目的在于进行组

39、织或器官替换。1997年3月，第一个组织工程产品人工皮肤经美国FDA批准上市。·由新生儿的包皮成纤维细胞培植而成，种植在聚乳酸和聚乙醇酸的支架上，呈层状结构，与人正常的皮肤极为相似，能分泌人体皮肤胶原、生长因子和结构蛋白。·移植数星期后，该支架材料逐渐降解，形成与正常皮肤结构类似的组织，并与病人的皮肤很好地融合，不存在排异反应等，愈后不留瘢痕。38、简述逆转录病毒载体系统的组成和功能。逆转录病毒载体系统由两部分组成：（1）逆转录病毒载体：保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；能够携带外源基因进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上。但不能自我包装成有增殖能力的病毒

40、颗粒。（2）提供病毒结构蛋白的包装细胞，能高效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒。39、外源基因在转基因动物细胞中高效表达的常用什么策略？简述其原理。原理：氨甲喋呤（Mtx）是动物细胞关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的抑制剂。利用对Mtx抑制作用有抗性的细胞能高效扩增dhfr基因及其相邻的染色体片段的现象，设计外源基因在哺乳动物中高效表达的策略。细胞经过氨甲蝶呤处理后存活下来的细胞中dhfr基因得以扩增，提高二氢叶酸还原酶的表达水平，抵消氨甲蝶呤的抑制作用，与该基因相邻的染色体片段同样扩增。将外源目的基因与dhfr基因连接构建重组分子，进行转化和筛选。40、简述转基因动物培育的技术路线，分析几种

41、转基因方法的原理和特点。转基因动物技术路线：外源目的基因的制备外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞筛选携有目的基因的细胞转基因动物胚胎发育转基因动物检测与鉴定（1）显微注射法是创造转基因动物的有效途径。基本原理：用显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核中，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。（2）胚胎干细胞介导法把外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选获得整合稳定和表达良好的转化细胞系，将转化细胞注入受体囊胚腔中，将受体囊胚腔移植到假孕动物体内，可获得由ES细胞介导的含目的基因的个体。（3）精子载体法直接以精子作为外源DNA载体的转基因方法。精子直接与外源DNA混合培养，外源基因

42、可以进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。（4）反转录病毒感染法将目的基因重组到反转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后的胚胎，或直接将胚胎愈能释放反转录病毒的细胞共孵育达到感染目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中。（5）胞核移植法以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，利用克隆动物技术得到转基因动物。41、最有发展前途的动物生物反应器是哪一种？简述其原理和生产药用蛋白的优势。动物乳腺生物反应器原理：利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的乳液中获取重

43、组蛋白。动物乳腺生物反应器生产药用蛋白的优势：（1）生物活性高，无污染（2）易分离提纯，成本低廉（3）产量高42、植物组织表现全能性的条件？一是植物组织或细胞脱离原来所在的植物体而处于离体状态（必须从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，离体损伤刺激是细胞脱分化的重要条件之一）。二是给予适当的刺激，即给予一定的营养物质和激素的刺激。43、请分析激素在植物再生过程中的作用。生长素和细胞分裂素是植物再生中不可缺少的激素，两者的平衡能调节大多数植物的器官发生，二者的配比是影响脱分化和再分化的关键。激素对植物生长发育的调控普遍存在双重性，即只有在适宜浓度才发挥生物学效应，过低不起作用，过高则产生抑制。44、何谓愈伤组织？在植株再生中有何重要性？愈伤组织：基上由外植体上形