田国帅 Translation

1、阿霉素引起大鼠胚胎H9c2心肌细胞肥大并不必需激活钙依赖磷酸酶：磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶Akt路径参与 摘要钙/钙调素依赖磷酸酶已被发现是在体内外诱导心肌肥厚的必需物质。抗肿瘤药物阿霉素（DOX）可激活在H9c2心肌细胞的钙依赖磷酸酶信号。然而这种导致肥厚的机制并未被研究。因而本研究的目的在于探究阿霉素诱导心肌细胞肥大过程中钙依赖磷酸酶活化情况。在钙调磷酸酶抑制剂环孢素A（CsA或FK506存在情况下，用1M阿霉素对H9c2心肌细胞预处理2小时。治疗8至48小时后，对钙调神经磷酸酶信号转导和细胞肥厚进行分析。阿霉素的处理活化钙依赖磷酸酶信号并导致细胞肥大的同时，细胞体积的和细胞蛋白含量有所增

2、加。钙依赖磷酸酶的抑制剂CsA、FK506阻止阿霉素诱导的钙依赖磷酸酶信号。然而这并没有阻止抑制阿霉素诱导的H9c2心肌细胞肥大反应。进一步评估阿霉素诱导H9c2心肌细胞肥大可能的信号表明，阿霉素处理导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷酸化,这是磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的下游反应。此外，阿霉素诱导肥大反应受到PI3K特异性抑制剂LY294002 2 -（4-吗啉基）- 8-苯-4H-1-苯并吡喃-4-1 的抑制。以上研究结果表明，虽然钙依赖磷酸酶受到阿霉素处理的活化，但对阿霉素诱导的心肌细胞肥大并不必需。相反，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶Akt信号通路在阿霉素诱导心肌细胞肥大过

3、程中起到更重要的地位。 心肌肥大是一种对大量内外刺激因素的主动适应，表现在心肌细胞的大小和蛋白质的合成，肌节组织的增加和心脏基因程序表达（Frey和Olson，2003）。长期肥大是众多心血管疾病的终点，并会导致心律失常、猝死和和心脏衰竭（Ho et al，1993；Lloyd-Jones 等人，2002）.调控心肌细胞肥大的分子机制吸引了众多关注，并且在这过程中存在众多信号转导通路（Frey和Olson，2003）。其中一个通路涉及钙/钙调素依赖的蛋白磷酸酶钙依赖磷酸酶。 缩写：NFAT，活化T细胞核因子；DOX，阿霉素；CsA，环孢霉素A；FK506，他克莫司；PI3K，磷酸肌醇3激酶；I

4、GF-1，胰岛素样生长因子-1；LY294002， 2 -（4-吗啉基）- 8-苯-4H-1-苯并吡喃-4-1 ；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；DMEM，杜尔贝克改良艾格培养基；FBS，牛胎血清;PBS,磷酸盐缓冲生理盐水；BSA，牛血清白蛋白；MOPS，4 morpholinepropanesulfonic酸；DTT，二硫苏糖醇；AdNFAT- luc，腺病毒荧光素酶记录因子；ANONA，方差分析。 钙依赖磷酸酶是一种广泛表达丝氨酸和苏氨酸的磷酸酶，可被细胞内持续升高的活性钙激活。活化的钙依赖磷酸酶已被发现是在体内外诱导心肌肥厚的必需物质（Molkentin et a

5、l，1998）。活化的钙依赖磷酸酶可促使活化的T细胞（NFAT）核因子去磷酸化，这是钙依赖磷酸酶引起的基础性下游转录效应(Crabtree and Olson, 2002)。由钙依赖磷酸酶介导的NFAT去磷酸化引起NFAT核快速导入，诱导胎儿心脏基因表达并引发随后的肥大反应（Molkentin et al，1998；Crabtree and Olson, 2002）。钙依赖磷酸酶已被证明参与培养的新生代心肌细胞针对苯肾上腺素和血管紧张素II以及和最近已被证明可抗肿瘤药物阿霉素（DOX）等兴奋剂的肥大反应(Molkentin 等人, 1998; Kalivendi 等人,2005)。阿霉素是化学

6、医疗试剂多组分中一个有价值的成分，然而，严重的心脏毒性是影响其临床应用主要限制因素（Ferrans，1978）。在体内，阿霉素治疗会导致心脏肥大（Sun 等人, 2001）。在体外，阿霉素治疗会致使初生大鼠心肌细胞肥大，并伴随着心肌细胞体积和细胞蛋白含量增加（Tu 等人, 2002）。在这个过程中所涉及的分子机制从未被深入研究。 本研究的目的在于探究阿霉素诱导心肌细胞肥大过程中涉及钙依赖磷酸酶活化程度。采用 H9c2 大鼠心肌细胞和钙依赖磷酸酶的药理抑制剂环孢素A（CsA）和FK506，我们发现，尽管钙依赖磷酸酶被阿霉素处理激活 ，但对阿霉素诱导的细胞肥大不必要。进一步探究在阿霉素导致细胞肥大

7、过程中可能的信号参与通路，揭示了磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 (PI3K)Akt信号通路的关键作用。材料与方法 材料与试剂 阿霉素，环孢素A，和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）均购自Sigma公司（St. Louis, MO）。FK506源自PKC制药公司（Woburn，MA）。LY294002源自Calbiochem公司（La Jolla，CA）。钙调神经磷酸酶底物RII购自Bachem公司（King of Prussia, PA)）。其他试剂均为Sigma公司，且至少是分析级量。使用的抗体及其来源如下：抗磷酸化Akt（Ser473）是细胞信号转导技术公司（Beverly, MA），Akt抗

8、体和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体均来自 Santa Cruz生物科技公司 (Santa Cruz, CA)。细胞培养与治疗 来自于美国培养保藏公司（Manassas, VA）的胚胎大鼠心肌细胞H9c2，培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA）中，该培养基含10%胎牛血清（FBS; Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA），谷氨酰胺（4mM），1.5 g/L碳酸氢钠，青霉素（100单位/毫升），链球菌霉素（100克/毫升）。细胞于37°C95%环境空气和5%CO2共同的水

9、饱和下保存。培养物在2 - 3天的间隔内传代。细胞接种在密度为 6.5*105细胞100毫米培养皿中,并进行钙调神经磷酸酶磷酸酶测定和免疫印迹分析,同时在密度为8.5 *104细胞的35毫米培养皿中进行细胞蛋白含量和细胞大小的测量。在含10%胎牛血清的DMEM培养基进行实验前。细胞要培养24小时. 对于涉及环孢素，FK506，LY294002的实验，H9c2心肌细胞应在阿霉素添加之前用环孢素，FK506，LY294002预处理2 h。细胞于37°C在含10%牛胎血清、5%CO2的DMEM培养液中并在阿霉素存在情况下培养生长2 h。2小时后，移除阿霉素和培养基，并添加新鲜的培养基和环孢

10、素，FK506，或LY294002到细胞，继续进行6、22或46小时的培养。 细胞蛋白含量测定 细胞在35毫米细胞培养基用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)消化收集和用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次。随后通过离心并用15 l 细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH值7.5，150毫摩尔/升氯化钠，1毫摩尔/升Na2EDTA，1毫摩尔/升EGTA，1% Triton X-100，2.5毫摩尔/升焦磷酸钠，1毫摩尔/升-磷酸甘油钠，1毫摩尔/升Na3VO4，1微克/升亮肽素，1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟）在冰上裂解细胞30分钟。悬浮液在4°C14000克离心10 m

11、in并收集上清液。用Bradford法（Bio-Rad, Hercules, CA）测定牛血清白蛋白（BSA）作为标准测定所有细胞裂解液中的蛋白质浓度。单个细胞蛋白含量用用血细胞计数仪测定细胞的总蛋白量除以细胞数计算。细胞大小测量 贴壁细胞在35毫米培养皿中经胰酶消化分离，并利用附有数码相机和20个镜头（尼康，东京，日本）的尼康TE2000-S显微镜观察圆形细胞图像。用微软办公文件成像软件（微软，Redmond，WA）测量细胞直径，并使用球体体积计算公式（4 / 3*半径3）计算细胞体积。随机测量单个细胞的直径测量和每实验区域内100个细胞。钙依赖磷酸酶活性测定 使用之前描述的磷酸酶钙调神经磷

12、酸酶活性测定方法（Fruman etal., 1996)测酶活性。简而言之，在体外，钙调神经磷酸酶底物RII被250 U重组蛋白激酶A 催化亚基，50毫摩尔/升ATP，50Ci -32P ATP，0.15毫摩尔/升超薄肽，和500l 2激酶反应缓冲液（40毫摩尔/升MOPS，pH值7，4毫摩尔/升 MgCl2，0.1毫摩尔/升CaCl2，0.4毫摩尔/升EDTA0.8毫摩尔/升EGTA，0.5毫摩尔/升DTT，0.1 毫克/毫升 BSA）磷酸化。处理后，H9c2心肌细胞通过离心分离沉淀，用冰冷的PBS洗两次，在50 l 低渗裂解缓冲液（50 毫摩尔/升 Tris-HCl，pH值7.5，0.5毫

13、摩尔/升DTT，1毫摩尔/升EDTA,0.1毫摩尔/升EGTA，0.5毫摩尔/升苯甲基磺酰氟，1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒）通过三个周期液氮冷冻和30°C水浴裂解。悬浮液在4°C14000克离心10 min ，收集上清液。随后每个样品的蛋白浓度用Bradford法测定其浓度，并且每个样品浓度调整为0.5至1毫克/毫升的裂解缓冲液。用培养各样品中钙调神经磷酸酶活性等部分反应缓冲液（50 毫摩尔/升 Tris-HCl，pH值7.5，100毫摩尔/升NaCl，0.5 毫摩尔/升 DTT，0.1 毫克/毫升BSA，0.5毫摩尔/升CaCl2，100毫摩尔/升钙调素，和1微摩尔/升okad

14、aic acid）测定其活性，稀释样品的蛋白质，并在30°C下标记的作用肽标记10分钟。5%氯酸中的500l 0.1 摩尔/升磷酸钾缓冲液停止反应。要确定每个样品中释放的磷酸盐，将样品加入到如之前所述（Fruman etal., 1996）的含有Dowex AG 50W-X8离子交换树脂（Bio-Rad）的自旋色谱柱（Bio-Rad）。通过每一列流动，然后加入到5毫升的闪烁液体，并在闪烁中心测量磷酸盐释放量。调整蛋白质量，使不到25%在反应期间被分解。由磷酸酶测定多次重复的每分钟计数值平均值，并将所得的值减去计数每分钟在缺乏细胞裂解液时的空白值。此值除以底物具体反应活性可得皮摩磷酸盐

15、释放量。由此产生的值除以反应时间和蛋白质的量最终的值表示为皮摩尔每分钟每毫克蛋白磷酸。腺病毒传播与感染 腺病毒荧光素酶记录因子(AdNFAT-luc) 由杰弗里D.莫克亭博士（University of Cincinnati, OH）慷慨提供，此前已描述（Wilkins 等人, 2004）。腺病毒荧光素酶在人胚胎肾293细胞中传播，可通过ViraBind腺病毒纯化试剂盒（Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA）纯化。H9c2心肌细胞于37°C在含2%牛胎血清的磷酸盐缓冲液和5%CO2下培养2 h，形成单位细胞内100空斑的多重感染，随后在含牛胎血清的新鲜培

16、养基中培养22小时。在感染24小时后，用含10%牛胎血清的DMEM培养液继续在治疗前培养24小时。在这些情况下，约98%的细胞被感染，对同一浓度下的Ad-GFP感染情况进行评估。荧光素酶酶法 荧光素酶活性用荧光素酶检测系统(Promega, Madison, WI)依据供应商的引导测定细胞提取物。用照度计 (LMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 测量超10s的光照强度，相对光单位表现为超10秒/克蛋白。免疫印迹分析 用细胞裂解缓冲液制备上述细胞提取物。全细胞裂解液的蛋白质浓度用Bradford法测定牛血清白蛋白为标准。采用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电

17、泳分解细胞裂解液（50微克），并转移到聚偏二氟乙烯膜。随后，膜于4°C下在初级抗体（抗磷酸化Akt，抗性Akt，GAPDH抗体）中极快形成，二次抗体与山葵过氧化物酶在室温下1小时结合。膜通过化学发光试剂盒（GE Healthcare, Piscataway, NJ）生长。使用ImageQuant5.2软件（GE Healthcare）进行密度计量。统计分析 数据以平均数（方差）表示。数据通过单向方差分析(ANOVA)后采用Bonferroni法进行多重比较。实验涉及双因素实验因子，进行双向方差分析。一个显著的相互作用被双向方差分析检测后，主要影响因子进一步确定。影响因子的意义是P&l

18、t;0.05。结果阿霉素引起依赖剂量的肥大反应和H9c2细胞钙依赖磷酸酶活性 为了确定阿霉素是否可引起大鼠H9c2心肌细胞肥大，我们把心肌细胞放置在浓度不断增加的阿霉素（1，2，和5毫摩尔/升）中2小时。处理后，细胞在新鲜的含10%牛胎血清的DMEM培养基进行另外22小时的恢复生长（共24小时），随之进行细胞体积和单位细胞内蛋白质含量的测定。H9c2心肌细胞当在阿霉素处理后细胞体积和细胞24 h蛋白含量随剂量的增加而增加（图1，A和B）。 钙/钙调蛋白依赖的蛋白磷酸酶已被证明是体内和体外诱导心肌肥大必需的（Molkentin 等人, 1998）。因此，我们研究了阿霉素对H9c2心肌细胞钙依赖磷

19、酸酶活性的影响。H9c2心肌细胞在浓度不断增加的阿霉素（1，2，和5毫摩尔/升）处理2 h又在含10%牛胎血清的新鲜培养基中恢复6小时（共8小时）后，检测总钙依赖磷酸酶酶活性。通过钙依赖磷酸酶活性测定法的测定，阿霉素诱导处理的钙依赖磷酸酶活性随剂量增加而增加（图1c）。孢环素A和FK506抑制阿霉素引起的钙依赖磷酸酶-NFAT信号 NFAT转录活性分析是一种功能性评价钙依赖磷酸酶活性和钙依赖磷酸酶激活评价方法（Wilkins 等人, 2004）。为了更仔细地观察阿霉素引起的钙依赖磷酸酶激活和钙调磷酸酶-NFAT信号通路，用含荧光素酶的腺病毒感染大鼠H9c2心肌细胞。被含荧光素酶的腺病毒感染的大

20、鼠H9c2心肌细胞用1毫阿霉素处理 2 h又经过22 h恢复引起了腺病毒荧光素酶记录因子活性显著增加（图2）。 为了验证当前实验条件下记录因子的特异性，被含荧光素酶的腺病毒感染的大鼠H9c2心肌细胞先加入钙依赖磷酸酶抑制剂孢环素A和FK506，随后加入1 摩尔/升DOX处理2 h。处理后，细胞在含抑制因子的新鲜培养基中恢复22小时。在100纳摩尔/升的孢环素A或1摩尔/升FK506存在条件下，阿霉素引发的NFAT记录因子活动明显减少（图2）。这些钙依赖磷酸酶-NFAT记录因子检测的结果不仅验证了记录因子的特异性，也进一步证实了阿霉素可激活钙依赖磷酸酶。孢环素A和FK506不抑制阿霉素引起的细胞

21、肥大 如果钙依赖磷酸酶的激活介导阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大，孢环素A和FK506会抑制阿霉素引起的心肌细胞肥大。在H9c2心肌细胞中先加入钙依赖磷酸酶抑制剂孢环素A和FK506，随后加入1 摩尔/升DOX处理2 h。2h后，细胞在含抑制因子的新鲜培养基中恢复生长46小时（共48小时）。尽管细胞体积和单位细胞蛋白含量在1 摩尔/升DOX处理后显著增加，孢环素A和FK506的处理并未抑制阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大（图3，A和B）。总结起来，这些结果表明尽管钙依赖磷酸酶受到阿霉素的激活，但对阿霉素引起的并不必需。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶Akt路径参与阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大 假

22、如钙依赖磷酸酶不参与阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大，那么阿霉素引起的心肌细胞肥大所涉及的信号通路是什么？阿霉素已被证明活化/磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（Deres 等人, 2005; Li 等人, 2005），并且在转基因小鼠中Akt持续心脏特异性激活表达已被证明诱导大鼠心肌肥厚（Matsui 等人, 2002; Shioi 等人, 2002）。因此，我们检测Akt参与阿霉素引起的心肌细胞肥大的可能途径。心肌细胞分别放置于1摩尔/升 DOX 5、15、30或60分钟或2小时，随后移除DOX1h（180分钟）或4h（360分钟）. 进而评估Akt丝氨酸473（Ser473）磷酸化的作用

23、。加入另外的DOX180分钟后，检测到Akt的Ser473磷酸化，并持续了360分钟，而总Akt水平不变（图4A和B）。作为阳性对照，H9c2心肌细胞放置在胰岛素样生长因子-15分钟导致Akt Ser473的快速磷酸化（图4A和B）。 主要的上游调节Akt通路是PI3K。因此，我们随即测验了阿霉素引发的心肌细胞肥大过程中PI3K参与的可能性。H9c2心肌细胞先放置于浓度不断增大的PI3K特异性抑制剂LY294002，随后加入1摩尔/升DOX处理2小时。2小时后，细胞放置在一个含LY294002的新鲜培养基中恢复生长46小时（共48小时）。单位细胞蛋白质含量的测定结果表明LY294002抑制DO

24、X引起的单位细胞蛋白质含量随阿霉素增多而增多的现象，可完全（图5）。此外，20微摩尔/升LY294002不仅抑制DOX引起的单位细胞蛋白质含量增多，并且这个PI3K抑制剂浓度可明显抑制阿霉素引发的细胞体积的增加（图6A和B）。还应指出的是，单独处理H9c2心肌细胞的20微摩尔/升LY294002没有细胞毒性（数据未显示）。这些结果表明PI3K-Akt信号通路在阿霉素引起的细胞肥大过程中至关重要。讨论 本研究结果表明阿霉素处理处理H9c2心肌细胞激活了钙依赖磷酸酶 NFAT信号，同时导致细胞肥大，并伴随细胞体积的增大和细胞蛋白含量增多。钙依赖磷酸酶抑制剂孢环素A和FK506阻碍Dox引发的钙依赖

25、磷酸酶 NFAT信号转导；然而，这些抑制剂并不妨碍阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大反应。这些结果表明Dox诱导Akt磷酸化和来自于PI3K特异性抑制剂LY294002的数据表明PI3K-Akt信号通路在阿霉素引起的细胞肥大过程中至关重要。 H9c2心肌细胞常被用来作为体外模型以研究阿霉素引起的心肌细胞肥大过程的机制和信号转导途径，同时也作为过氧化氢(H2O2）引起肥大的实验模型（Chen 等人, 2000）。H9c2心肌细胞系来源于克隆胚胎大鼠心室心肌细胞。这些细胞内含许多心肌细胞分子标记和形态学上的未成熟胚胎心肌细胞特征，尽管这些细胞在一定程度去分化（Hescheler 等人, 1991）。

26、即便如此，心肌细胞在双氧水处理下肥大被认为类似于原发性乳鼠心肌细胞肥大，维持了心脏细胞在体内的许多特性（Chen 等人, 2000）。因此，这些细胞被选为研究参与DOX引起的心肌细胞肥大信号通路。 心脏肥大是心血管疾病常见的终点，其特点是心肌细胞大小和蛋白含量的增加。大量信号转导途径参与在心肌肥大过程中，其中一个便是钙/钙调素依赖性蛋白磷酸酶。钙依赖磷酸酶已被证明在体内外引起心肌肥大是必需的（(Molkentin 等人, 1998）。近日，kalivendi等人（2005）表明蒽环类醌DOX激活钙依赖磷酸酶-NFAT信号在H9c2心肌细胞的转导。然而，这种激活效果并未被证实。阿霉素已被证明可在

27、体内引发心肌肥大（Sun等人，2001）。DOX原发性新生大鼠心肌细胞的处理通过衡量细胞体积和单位细胞蛋白质含量的增多会加剧心肌细胞肥大（Tu等人，2002）。因此，在这项研究中，我们力图检验阿霉素引起H9c2心肌细胞肥大过程中钙调神经磷酸酶活化参与度。结果表明，虽然钙调神经磷酸酶被阿霉素激活，但对阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大并不必需。 虽然钙依赖磷酸酶的充分性作为心肌肥大反应的转发器被很好地记录，但其在促进心肌肥大工程中的必要性不清楚。尽管有些研究表明了钙依赖磷酸酶信号转导在肥大反应中的必要性，但若干研究采用多种模型表明孢环素A和FK506在心肌肥厚发展过程中没有任何影响（(Luo 等人

28、, 1998;Mu ller 等人, 1998; Sussman 等人, 1998; Ding 等人, 1999;Zhang 等人, 1999）。此外，另外的研究使用一个家族性心肌肥大模型发现孢环素A和FK506的处理加剧了肥大反应（Fatkin 等人，2000；Schmitt等人，2003）。虽然这些涉及到孢环素A和FK506的研究的有效性由于他们没有特异性反应已被质疑，但更可能的是，观察到的心脏肥大反应具有模型依赖性和多方面的性质，从而涉及钙依赖磷酸酶独立信号途径。目前的研究结果支持这一假设，因为钙依赖磷酸酶抑制剂孢环素A和FK506未能抑制阿霉素引起的心肌细胞肥大，而PI3K特异性抑制剂

29、LY294002 可阻碍Dox诱导的心肌细胞肥大。 PI3K是一种已被证明在包括细胞生长增殖生存等众多细胞功能中发挥至关重要的脂质激酶（Cantley，2002）。位于受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体下游的PI3K催化另一个磷酸基团到磷脂酰肌醇肌醇环的游离3端，得到的产物可激活细胞肥大过程中信号转导通路（Chen等人 , 2001）。PI3K的激活在体内已被观测到肥大压力超负荷，同时在小鼠心脏中PI3K激活特异性表达导致心肌细胞增加，进而引起心脏变大。（Naga Prasad等人，2000；Shioi等人，2000）。相反，相比正常小鼠，PI3K显性负突变体的表达导致较小的心脏、心肌细胞（Shi

30、oi等人，2000）。在体外，PI3K被H2O2激活，同时PI3K抑制剂与渥曼青霉素抑制H2O2诱导的心肌细胞肥大（Tu等人，2002）。此外，作为PI3K下游主要感受器的一种Akt活化形式在心脏特异性表达导致转基因小鼠心肌显著肥大（Matsui 等人, 2002; Shioi 等人，2002）。此外，在体内外，PI3K-Akt信号通路参与肥大的多种形式（Ha 等人, 2005; Kenessey and Ojamaa, 2006）。总的来说，这些数据表明PI3K-Akt信号在心肌肥大发展过程起到了作用。 我们的研究揭示了PI3K在阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大过程中潜在的重要作用。PI3K

31、参与阿霉素引起的肥大的发现与PI3K参与氧化应激引起的肥大观察结果相一致（Chen等人, 2000; Tu 等人,2002）。在细胞内代谢过程中阿霉素心脏毒性涉及的机制包括活性氧的产生和氧化应激（Myers 等人, 1977;Kang 等人, 1996, 1997; Sun 等人, 2001）。NADH还原酶促使DOX代谢，该过程涉及线粒体呼吸链复合物I。在该反应中，阿霉素被转化为减少的半醌自由基（Davies and Doroshow, 1986）。这些半醌自由基中间体高度不稳定，能迅速与分子氧反应生成超氧化物并伴随DOX的完整再生（Jung和Reszka，2001）。此外，DOX在线粒体中

32、的氧化还原循环不仅产生超氧化物，也产生双氧水和羟基自由基(Doroshow and Davies, 1986)。尽管在体内外，氧化应激参与阿霉素引发的肥大，但PI3K/Akt的作用尚缺评估。本文获得的数据表明氧化应激激活PI3K/Akt信号转导是参与DOX诱导肥厚的一个潜在机制。虽然未来的研究将进一步确认PI3K/Akt信号通路参与阿霉素引起的肥大，可以预测的是其他的路径可能也涉及其中。事实上，阿霉素可同时激活多个信号转导通路，包括参与肥大发展（Zechner等人，1997；Wang等人，1998）的p38丝裂原活化蛋白激酶信号途径（Kang 等人，2000）。此外，我们最近的研究表明阿霉素处

33、理可导致特定线粒体蛋白的修饰（Merten等人，2005）。阿霉素可激活多个信号分子通路的事实可能暗示着在多个引起肥大的信号转导通路存在交流，因此，接下来仔细研究、评估在阿霉素引起心肌细胞肥大过程中这些途径是必要的。致谢 我们感谢Johnny Morehouse和陈静的技术支持。 参考文献图1 阿霉素引起的H9c2心肌细胞肥大药物剂量反应和钙依赖磷酸酶活性。H9c2心肌细胞在含10%牛胎血清并存在浓度不断增大的阿霉素（1，2，和5微摩尔/升）的DMEM培养基培养2小时，随后放在含10%牛胎血清的新鲜培养基培养另外的22h（A和B）或6h（C）。依据材料与方法中提及的方法测量细胞体积（A），单位细胞蛋白含量（B），钙依赖磷酸酶酶活性（C）。数据是指每实验组（A）100个细胞的数据或三个实验组中选取的一个代表组数据的三倍（B和C）。*，表示与对照组有显著差异。图2 H9c2心肌细胞中腺病毒荧光素酶记录因子活性。受腺病毒荧光素酶记录因子感染的心肌细胞在2h的1微摩尔/升阿霉素处理前，在含10%牛胎血清和100纳毫摩尔/升的CsA或1微摩尔/升FK506 的DMEM培养基进行预处理 2 h。随后细胞在含10%牛胎血清和抑制剂