Tan第四章 目的基因的制备

1、2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 1本课程内容 第一章第一章 绪论绪论 第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶 第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体 第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备 第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选 第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达 第七章第七章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术 第八章第八章 植物基因工程及应用植物基因工程及应用 第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用 第十章第十章 医学基因工程及应用医学基因工程及应用2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！

2、Slide 2第四章 目的基因的制备目的基因目的基因（target gene）是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或基因或DNA片段。片段。是编码某一产物与某些性状相关的基因是编码某一产物与某些性状相关的基因本章分两节本章分两节4.1 目的基因的制备方法目的基因的制备方法4.2 克隆基因的分离克隆基因的分离2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 34.1 目的基因的制备方法4.1.1 直接分离法直接分离法4.1.2 构建基因文库分离法构建基因文库分离法4.1.3 PCR法法4.1.4 化学合成法化学合成法2021年11月2

3、3日3时08分欢迎同学们听课！Slide 4 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使使用以下的方法克隆目的基因用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或或RT-PCR法法2. 从基因文库中分离基因从基因文库中分离基因3. 从从cDNA文库中分离基因文库中分离基因4. 转座子标签法转座子标签法5. 图位克隆法图位克隆法6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法差减杂交法、扣除杂交、差异显示法7. 人工合成法人工合成法本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。获得目的克隆的方法有两种获得目

4、的克隆的方法有两种1） 目的基因的直接选择目的基因的直接选择2） 从基因文库中筛选从基因文库中筛选2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 54.1.1 直接分离法 直接选择的基因比较少，如直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因抗生素抗性基因。如克隆一。如克隆一个个kan抗性基因，在抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在抗性基因存在于于13个个EcoRI片段中的一段中。将片段中的一段中。将R6-5的片段插入的片段插入pBR322的的EcoR I位点中，连接混合物中

5、将含有位点中，连接混合物中将含有13个不个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有抗性的。只有含含kan的克隆才能在含有的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。的培养基上正常生长。1） 标记援救可以扩大直接选择的范围标记援救可以扩大直接选择的范围利用利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆中克隆trpA基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。2021年11月23日3时08分欢迎

6、同学们听课！Slide 6 因此因此E. coli的突变体可以用来克隆的突变体可以用来克隆trpA基因。首基因。首先从一个正常个体中提取总先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连，然后酶切，连接产生大量重组接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整分子，其中一个将携带完整的的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 7直接选

7、择法克隆直接选择法克隆KanKan抗性基因抗性基因2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 8 2）标记援救的范围和限制存在两个限制因素：1） 必须存在着目的基因的突变品系2） 需要一种只有野生型能够生长的培养基。一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶可以在基本培养上选择。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 9标记拯救法克隆标记拯救法克隆trpAtrpA基因基因 2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 10 4.1.2 构建基因文库分离法4.1.2.1 基因组文库的构建基因组文库的构建4.1.2.2 cDNA文库的构建文库的构建4.

8、1.2.3 基因文库的筛选基因文库的筛选2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 11基因文库（gene library） 基因文库：基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合（所有基因的足够数目的克隆的集合（将生物材料将生物材料的基因组的基因组DNA或或cDNA片段化，然后与特定的载体连接片段化，然后与特定的载体连接导入宿主菌形成包含目的基因在内的导入宿主菌形成包含目的基因在内的DNA片段的片段的克隆克隆群）群）。基因文库是通过纯化细胞总。基因文库是通过纯化细胞总DNA，然后利，然后利用特定的限制性酶酶切产生能插

9、入载体的片段，用特定的限制性酶酶切产生能插入载体的片段，一般是一般是替换载体、粘粒或者是替换载体、粘粒或者是YAC。 2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 12 对于植物、动物，所需要的克隆数很大，鉴定目的基因是一项艰巨的任务。对于这些生物体，可以使用细胞特异的cDNA文库。cDNA文库是将mRNA反转录成cDNA，插入载体中构建的文库。每一个细胞都含有相同的基因，但不同细胞中有的基因是表达的， 而有的基因关闭。只有少量基因在所有的细胞类型中都表达，利用mRNA构建的基因文库，只含有表达的部分基因。例如麸朊（醇溶朊），小麦中的一种营养蛋白，在正发育的种子中，以非常高的水平

10、表达，大约占总mRNA的30%。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 134.1.2.1 基因组文库的构建 基因组文库（基因组文库（genomic library） 某种生物的基因组的全部遗传信息（某种生物的基因组的全部遗传信息（DNA序列）通序列）通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体中，这个群体即为过克隆载体贮存在一个受体菌的群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。这种生物的基因组文库。 基因组文库中的各克隆的插入片段叠加起来应包含了基基因组文库中的各克隆的插入片段叠加起来应包含了基因组的全部序列。因组的全部序列。 基因组文库的克隆数目基因组基因组文库的克隆数目基因组D

11、NA总长总长/DNA插入片段插入片段的平均长度的平均长度 Clark 和和Carbon 提出估算基因组文库大小的经验公式：提出估算基因组文库大小的经验公式： Nln(1-P)/ln(1-f) N：基因文库必需的克隆数目；：基因文库必需的克隆数目； P：文库中含目的基因：文库中含目的基因DNA片段出现的概率；片段出现的概率； f：插入片段的大小与基因组大小的比值。：插入片段的大小与基因组大小的比值。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 14基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 15 噬菌体基因组文库的构建噬菌体基

12、因组文库的构建 Cosmid基因组文库的构建基因组文库的构建 YAC基因组文库的构建基因组文库的构建2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 164.1.2.2 cDNA文库的构建步骤 cDNA文库和文库和cDNA文库的大小文库的大小 cDNA文库（文库（cDNA library） 某种生物基因组转录的部分或全部某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经经反转录产生的各种反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA文库。文库。 Nln(1-P)/ln(1-f) N：

13、cDNA基因文库必需的克隆数目；基因文库必需的克隆数目； P：文库中含目的基因：文库中含目的基因cDNA片段出现的概率；片段出现的概率； f：某种：某种mRNA的丰度与总的丰度与总mRNA的数的比值。的数的比值。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 172021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 182021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 19 因为任何一种细胞中都只有部分基因表达，利用这一事实来制备基因文库：制作文库的起始材料不是DNA而是mRNA。 以mRNA为起始材料所得的克隆只包含整个细胞所有基因的一部分。 当目的基因在某一细胞

14、类型中高表达时，这种利用mRNA的克隆方法显得特别有用。 例如，麦醇溶蛋白是小麦中一种重要的营养蛋白，在发育的小麦种子中，编码的麦醇溶蛋白基因高水平表达。 这些细胞中总mRNA的30是麦醇溶蛋白的mRNA。 显然，如果从小麦种子中克隆mRNA，将会得到大量特异表达麦醇溶蛋白的克隆。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 20构建步骤 分离纯化分离纯化总总RNA及及mRNA cDNA第一链的合成第一链的合成 双链双链cDNA合成合成 与载体重组、转化与载体重组、转化2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 21cDNAcDNA文库的构建过程（文库的构建过程（

15、1 1）2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 22cDNAcDNA文库的构建过程（文库的构建过程（2 2）2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 232021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 242021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 252021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 264.1.2.3 基因文库的筛选 制备好合适的文库后，可利用许多方法对目的克隆进行鉴定。 虽然有一些方法是通过检测克隆基因的翻译产物来鉴定重组体的，但往往直接鉴定正确的重组体DNA分子更为容易。 这将用到一项重要的技术

16、探针杂交 (hybridization probing)技术。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 27 筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。探针是由目的基因的已知的信息决定的，有三种可能性：1） 目的基因在特定细胞中的丰度2） 基因所编码的蛋白质或者部分序列3） 基因是一个基因家族中的一个2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 28探针杂交原理探针杂交原理 任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。 但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。 这一现象不仅仅发生在

17、单链DNA分子之间形成DNA双螺旋，单链RNA分子之间以及单链RNA与单链DNA之间也可以杂交。 如果用目的基因的互补DNA或RNA作探针，就可利用核酸杂交(nucleic acid hybridization)鉴定出特定的重组体克隆。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 292021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 302021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 31原位杂交技术 由于一项由于一项20世纪世纪70年代发展而来的新技术，我们年代发展而来的新技术，我们并不需要纯化每一个重组体。这项技术就是原位并不需要纯化每一个重组体。这项技

18、术就是原位杂交技术。杂交技术。 重组体重组体DNA分子无论是存在于菌落中还是存在于分子无论是存在于菌落中还是存在于噬菌斑中，都可以用杂交探针技术鉴定出来。噬菌斑中，都可以用杂交探针技术鉴定出来。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 32方法： 首先把菌落或是噬菌斑转移到硝酸纤维膜或是尼龙膜上，处理除去杂质，只留下DNA。 通常以上处理步骤同时会使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键会断裂。 如所用的是硝酸纤维膜，短时间的80的加热会使这些单链DNA分子牢牢结合到膜上； 如果使用的是尼龙膜，处理方法相应的改为紫外光照射。 DNA分子与膜结合的部分是它们磷酸化的五碳糖主链，这样它

19、们的碱基是自由的，可以和互补的核酸分子配对。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 33 然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。 经过一段时间，等杂交已经发生后，洗去没有结合的探针，干燥，现在就可以检测结合的探针的位置。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 342021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 352021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 362021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 372021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 38探针标记

20、探针标记传统的方法是给探针标记上放射性的核苷酸。 标记的方法：缺口翻译、末端填平、随机引物法(random priming)图8-10。 其中随机引物法可以产生高活性的探针，能够探测出与膜结合得很少量的DNA分子。 用以上方法，杂交信号的位置可以通过放射自显影探测出来。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 392021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 402021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 41 不过，放射性标记已不再流行，部分是因为它对研究人员身体的伤害，部分是因为实验产生的放射性污染物的处理问题。 已开发出来的大量的非放射性方

21、法，下图解释了其中两种操作流程。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 42第一种方法： 使用dUTP和生物素(biotin)反应； 生物素是一种有机分子，与抗生物素蛋白(或亲和素，avidin)有很高的亲和性。 再用反应产物去标记探针，使探针带上生物素。 杂交后，用结合荧光标记的抗生物素蛋白去检出探针的位置。这种方法与放射性标记具有相同的敏感度，正变得越来越流行。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 432021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 44另一种方法： 将探针DNA分子用辣根过氧化物酶(horseradish peroxi

22、dase)标记; 辣根过氧化物酶有降解鲁米诺(氨基苯二酰肼)的活性，同时伴有化学荧光信号的发出。 与放射自显影类似，这种荧光信号可以被普通胶卷记录下来。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 452021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 46杂交探针实际应用的例子杂交探针实际应用的例子 从菌落或是噬菌斑中鉴定某个特定重组体的方法能否成功的一个前提：是否可以得到合适的核酸分子作探针。 探针至少与被克隆的基因有着部分序列的互补性。 当试验的目的是要获得某个原本不了解的基因时，要用什么来作为探针呢? 2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 4

23、7实际上，可以通过已有的有关该基因的信息来确定探针的性质。可以考虑以下3个可能性： (1)目标基因在某种细胞类型中高表达，可以考虑从这种特定细胞类型的文库中筛选该基因。 (2)该基因编码蛋白质的氨基酸序列已知或者部分已知。 (3)该基因属于某个已知的家族。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 48用高丰度重组体作探针分析用高丰度重组体作探针分析cDNA文库文库 当我们想获得在某种类型的细胞中有相对较高的表达当我们想获得在某种类型的细胞中有相对较高的表达量的基因克隆时，则先制备该细胞的量的基因克隆时，则先制备该细胞的cDNA文库。文库。 如制备正在发育的小麦种子的如制备正在

24、发育的小麦种子的cDNA文库中，有相当文库中，有相当大比例的克隆是麦醇溶蛋白基因的大比例的克隆是麦醇溶蛋白基因的mRNA。 鉴定麦醇溶蛋白克隆：用文库中的某一个鉴定麦醇溶蛋白克隆：用文库中的某一个cDNA克隆克隆作探针去检测文库中的其他克隆作探针去检测文库中的其他克隆(图图8-12)。 随机选择一个克隆，纯化重组随机选择一个克隆，纯化重组DNA分子，作上标记，分子，作上标记，用作探针检测其他克隆。用作探针检测其他克隆。 用不同的克隆作探针重复以上步骤，直到发现某一个用不同的克隆作探针重复以上步骤，直到发现某一个克隆可以与文库中相当大比例的克隆相杂交。克隆可以与文库中相当大比例的克隆相杂交。 这

25、个丰富存在的这个丰富存在的cDNA被认为很可能是麦醇溶蛋白，被认为很可能是麦醇溶蛋白，并进一步作更细致地分析以确定，如进行并进一步作更细致地分析以确定，如进行DNA测序测序或是分离它的表达产物。或是分离它的表达产物。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 492021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 502021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 51用于编码特定表达产物的基因的寡核苷酸探针用于编码特定表达产物的基因的寡核苷酸探针 由于蛋白质测序技术已经发展了四十多年，很多蛋白质的序列也是已知的。 如果已知氨基酸序列，就可以用遗传密码来预测

26、相应基因的DNA序列。 这种预测通常是不精确的，因为只有甲硫氨酸和色氨酸对应一个三联体密码，其他所有的氨基酸都至少由两个密码子编码。 然而，在大多数情况下，编码同一个氨基酸的密码子是有一定联系的。 例如丙氨酸，被GCA，GCT，GCG和GCC编码，三联体密码的三分之二可以很明确地预测出来的。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 52以细胞色素c为例说明 细胞色素c是一种需氧生物的呼吸链中起重要作用的蛋白质。早在1963年，就测出了来源于酵母的细胞色素c的氨基酸序列，结果显示在图8-13中。 这个序列包含一个片段，从第59个氨基酸起分别是Trp-Asp-Glu-Asn-As

27、n-Met。 由遗传密码可知，编码这个六肽的DNA序列是TGG-GATC-GAAG-AATC-AAT/C-ATG。 尽管存在16种不同的可能序列，但18个核苷酸中有14个是可以精确地预测出来的。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 53实验室中，长度小于实验室中，长度小于50bp的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列是可以很容易被合成出来的是可以很容易被合成出来的2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 54据预测的核苷酸序列，可以合成所需的寡核苷酸探针，有可能用这个探针鉴定目的基因。细胞色素c这个例子中，合成编码Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met的1

28、6种可能的寡核苷酸序列；分别使用16种探针或是混合作为一个探针库，检测酵母的基因组或是cDNA文库(下图8-15)。其中将会有一个探针是正确的序列，能够和细胞色素c基因的那个区域相杂交，而杂交的信号将指示出是哪一个克隆携带了该基因。从细胞色素c的蛋白序列中选出另外一个不同的片段，据此合成另一套寡核苷酸探针，用来检验第一次检出的结果。但是第二个片段的选择一定要注意：例如紧挨着上次选择的另一个六肽Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn，可能被几千种不同的18bp的DNA序列编码，很明显不是一个合适的选择。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 552021年11月23日

29、3时08分欢迎同学们听课！Slide 562021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 57用于鉴定相关基因的异种探针技术用于鉴定相关基因的异种探针技术 比较来源于不同生物、编码同一种蛋白质的两个基因时，通常会发现它们有着很高的序列相似性，这反映了在进化过程中基因结构的保守性。因此，根据其中一个物种基因合成的探针往往也能够与另一个物种基因进行很牢固的杂交。尽管两个DNA分子并不是完全互补的，只要能够形成足够多的核苷酸配对，杂交双链仍然是很稳定的。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 58 异种探针技术异种探针技术(heterologous probing)：

30、 利用几种不同来源的DNA分子相应序列间的杂交鉴定克隆的。例如，前面用寡核苷酸探针技术鉴定出了酵母的细胞色素c，可以作为杂交探针来鉴定其他生物中的细胞色素c基因，如脉孢菌(Neurospora crassa)中的细胞色素c基因。尽管它们并不完全配对，但足够多的氢键保证了杂交结构的形成，通过放射自显影探测出杂交信号。 试验的操作条件会有一些变化，因为杂交结构并不是很稳定，有可能在放射自显影前丢失掉探针。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 592021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 60异种探针技术还可以用来鉴定同种生物内的相关基因。 例如，前面部分鉴定

31、出了小麦的麦醇溶蛋白的cDNA克隆，用它作探针检测整个小麦的基因组文库，它杂交的不仅仅是它自身的基因，还会有一些其他的基因图8-16(c)。它们都是与麦醇溶蛋白cDNA相关的基因，只在核苷酸序列上有着轻微的不同。 这是因为麦醇溶蛋白和相关蛋白，形成了一个多基因家族(multigene family) 成员编码的复杂群体。 一旦克隆了这个家族中的一个基因，用异种探针技术可以把该家族中的其他成员分离出来。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 612021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 622021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 63基于

32、检测克隆基因产物的鉴定技术基于检测克隆基因产物的鉴定技术要从一个基因文库中鉴定某一特定的重组体，通常会优先考虑杂交探针技术。这项技术有着很好的操作性，而且由于近几年来的改进，利用杂交探针技术可以在一次试验中检测上万个重组体，从而把试验时间控制在一个相当短的时间范围内。然而，必须首先获得与目标基因在序列上至少部分互补的探针，这有时限制了它的应用。在有些情况下，需要使用另外一种策略。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 64杂交探针技术最主要的替代方法是免疫学筛查法(immunological screening)。它们的区别在于，杂交探针技术检测的是克隆基因自身，而免疫学筛

33、查法检测的是克隆基因编码的蛋白。免疫学技术认为，一旦克隆基因被表达，产物蛋白质在细胞中的含量将有别于它的正常含量。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 65免疫学检测方法需要的抗体免疫学检测方法需要的抗体 如果把纯化后的蛋白质样品注射进兔子的血液循环系统中，它的免疫系统将产生抗体来结合和帮助降解这些外源分子图8-17(a)。 一旦兔子被某种外源蛋白质所激发，它血液中的足以用来纯化的高抗体水平将会持续好几天。只要10 mL的血液就能提供相当多的抗体图8-17(b)。 被纯化后的抗体，有特异性，只能与最初被注射进兔子体内的蛋白质相结合。2021年11月23日3时08分欢迎同学

34、们听课！Slide 662021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 672021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 68用纯化后的抗体检测重组体的蛋白质用纯化后的抗体检测重组体的蛋白质 有好几种免疫学筛查的方法，但最常用的是直接配对检出。 把重组体克隆转移到聚脂膜上，裂解细胞，再加上包含特定抗体的溶液。 为了便于检出，或者抗体本身直接标记，或者抗原抗体结合后，用标记后的蛋白A(protein A)溶液洗膜。蛋白A是一种细菌蛋白，可特异地与免疫球蛋白(抗体的主要成分)相结合。 标记可以选择放射性元素，以这种方式结合的标记将通过放射自显影而被检测出来；或者也可以用荧

35、光或者化学发光的信号作标记。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 692021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 702021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 714.1.3 PCR法 PCR: polymerase chain reaction (聚合酶链聚合酶链式反应式反应)。 DNA片段体外扩增技术。片段体外扩增技术。 要求待扩增的要求待扩增的DNA片段的序列必需是已知片段的序列必需是已知的。至少要求的。至少要求DNA片段的两端约片段的两端约20bp的序的序列是已知的，以便设计引物进行扩增。列是已知的，以便设计引物进行扩增。 只用于

36、检测少量克隆的筛选。只用于检测少量克隆的筛选。2021年11月23日3时08分欢迎同学们听课！Slide 724.1.4 化学合成法 人工化学合成 随化学合成技术的发展，现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛应用，按人们设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段已不成问题。可能用这些合成的片段组合连接成完整的基因。但目前人工合成基因最大的限制是人们并未掌握怎样的核酸序列能具有生命功能的规律，例如1kb长的DNA最通常编码功能蛋白质的基因长度就可以有10600种不同的序列，随意合成的DNA绝大多数肯定是不具有生物功能或无法知道它会有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列来合成，而化学合成这样长的基因DNA序列，其价格远高于用PCR法获得基因，所以目前很少