超高效液相色谱_串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量

1、2009,8(3福建分析测试 Fujian Analysis & Testing23超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量林荆，郑宇，张金虎，吴文凡，赵建晖（福清出入境检验检疫局，福建福清350300）摘 要：本文建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）快速测定水产品中三聚氰胺残留的方法。色谱条件：ACQUITY UPLC BEH HILIC 柱（2.1 X 100 mm, 1.7m）,流动相：乙腈-0.5 mmol/L乙酸铵溶液 （0.1%甲酸），流速：0.3 mL/min。采用电喷雾质谱检测，以正离子模式5min就完成了质谱分析。实验结果表明，三聚氰胺在水

2、产品中的检测限 为0.05 mg/kg,在0.050.50 mg/kg添加水平时加标回收率为 63%90%之间，相对标准偏差（RSD, n=6均小于7.2%。关键词：三聚氰胺；水产品；超高效液相色谱-串联质谱；中图分类号：0657.63 文献标识码：A 文章编号：1009- 8143（2009）03-0023- 04Determ in ati onof Melami ne Residues in aquatic products by Ultra Performa neeLiquid Chromatography-TandemMass SpectrometryLin Jing, Zhen Yu

3、, Zhang Jin-hu, Wu Wen-fan, Zhao Jian-hui(Fuqing Entry- Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuqing, Fujian350300,China)Abstract: The residue of melamine in aquatic product was studied by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer.The sample was extracted and separatedon ACQU

4、ITY UPLC BEH HILIC column (2.1 X 100 mm, 1.7m) with acetonitrile-0.5 mmol/L ammonium acetate (0.1% formic acid) asthe mobile phaseat flow rate0.3 mL/min. The detectionwas performed by tandem mass spectrometrywith electrospray ionization in positive mode (ES+) in five minutes. Experimental results sh

5、owedthat the limit of detection was0.05 mg/kg, the recoveriesbetween0.050.50 mg/kg levels rangedfrom 63% to 90%. Relative standarddeviations(n=6) were less than 7.2%。Keywords: melamine; aquatic products; ultra performanceliquid chromatography-tandemmassspectrometer2009,8(3福建分析测试 Fujian Analysis &

6、; Testing#三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工中间 产品，这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，是建筑业中常用的防火材料 。目前三聚氰胺被 认为毒性轻微，长期摄入会造成生殖、泌尿系统损 害，并可进一步诱发膀胱癌。三聚氰胺是一种禁止 用于食品及动物饲料的化学物质，但是发生在美国的数起宠物饲料导致宠物死亡的事件，以及我国奶粉受三聚氰胺污染的“三鹿奶粉”事件，把三聚氰胺 和食品、饲料行业联系在一起13。由于一些不法厂 商通过添加三聚氰胺以增加产品的表观蛋白质含 量，导致了饲料生产商以及其它食品加工厂对产品 的生产过程进行三聚氰胺的检测，以保证产品安 全。水产品在养殖过程中大多得摄入饲料，

7、这也增加了三聚氰胺残留的风险。本文建立了超高效液相 色谱-质谱法测定水产品中三聚氰胺的残留量，该方法操作简单、选择性和灵敏度高、分析时间短，可 满足进出口水产品中三聚氰胺残留量检测分析和 确证工作的需要。1实验部分1.1 仪器与试剂超高效液相色谱仪 UPLC （美国Waters公司）， Premier四级杆串联质谱仪 （美国Waters公司），超 纯水仪（Millipore,Gradient）,均质器（德国 IKAT18）， 高速离心机Sigma2-5 （德国Sigma，分析天平2009,8(3福建分析测试 Fujian Analysis & Testing#2009,8(3福建分析测

8、试 Fujian Analysis & Testing#收稿日期：2009- 2- 13作者简介：林荆（1980-），女，助理工程师，从事食品检测工作。E- mail：r3osy2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量25BP211D，感量 0.0001g （北京 SARTORIUS，天平BH- 600,感量0.01g （上海英展）,ELx800酶标仪（德 国 Bio- tek。甲酸、甲醇、乙腈和乙酸铵为色谱纯 （Merck公 司），其它试剂均为分析纯 （中国国药化学试剂有限 公司），定溶液和流动相用水为Minipore-Q超纯水，其余皆为石英二次蒸

9、馏水。三聚氰胺标准品（Sigma-Aldrich 公司），强阳离子交换小柱（MCX， 60mg,3mL,美国 Waters公司）。标准溶液：准确称取标准品 10.0mg于50mL烧 杯中，用少量色谱纯甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，混匀，浓度为100mg/mL（该溶液在-18C冰箱 中可保存12个月）。根据实际需要再将其配成适当 浓度的标准工作溶液。1.2 实验方法1.2.1样品提取称取2.00g均质后的样品，置于 50mL离心管 中，加入10mL1%高氯酸提取液，匀浆 1min后， 10mL清洗均质头，合并提取液，酶标振荡1min,超 声提取30min，以3500r/min离心分离 5m

10、in,过滤 纸，取清液待净化。1.2.2固相萃取柱净化MCX小柱接于固相萃取装置中，顺次注入2mL甲醇、2mL水弃去流出液。柱中注入2mL“1.2.1”提 取方法所得的溶液后，注入3mL水，3mL甲醇，弃去 流出液。注入3mL氨水甲醇溶液 （体积比5:95,下同），收集流出液于鸡心瓶中，旋转蒸发至干，用2mL95%乙腈水溶解，过0.22mm滤膜，待测。1.3 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC ,2.1 X 100mm, 1.7mm（美国 Waters公司）；流动相：乙腈 -0.5mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸），梯度洗脱程序 见表1;流速:0.3mL/min

11、;柱温:35C ,进样量：10mL, 总运行时间：5min。表1流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradientelution programTimeAmmon iatcnetatAcetonit/min0 /%0 /%05950.55952.02 0802.55 0504.05951.4 质谱条件电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测MRM ;毛细管电压1.0 kV ;离子源温度120 C；去溶 剂温度350 C ；雾化器流速 700 L/h;反吹气流速50 L/h ;其它质谱参数见表 2。2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#2009,8(3林荆

12、等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#表2三聚氰胺的LC- ESI MS/MS仪器参数Tab 2HfC EMS/Nf）Saramfe dMic famineFormula（分子式）MRMtransition（MR离子对）m/zConveoltage（锥孔电压）V/VColl e»e o/g7（碰撞能量）C3N6H61 2 7/8257/6 83 02 72 02009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#2结果与讨论2.1 LC- MS/MS条件的优化实验发现，在流动相中加入乙酸铵可增加三聚 氰胺在柱中的保留，其分离度加大且峰形得到

13、有效 改善。选择甲醇和含 0.1%甲酸的乙酸铵溶液作为 流动相时，目标化合物的响应值比用乙腈和含 0.1%甲酸的乙酸铵溶液为流动相时低，可能因为 甲醇降低了目标化合物的离子化效率，目标化合物的响应值亦随之降低。以5 0%的乙腈水作为定溶 液时，三聚氰胺和周围的干扰峰分离不完全，无法进行定量，依据梯度洗脱程序， 选用9 5%的乙腈水 作为定溶液。液相色谱中使用的小柱虽然都是Wat 公司s的，但也经过了选择比较， 原先通用的 C8, C1柱子 都适用于有机相达到 90%及其以上比例的流动相， 直接调试三聚氰胺时，因为三聚氰胺分子量较小的 缘故，只有不断提高水相比例才能使得三聚氰胺的 峰形对称不形成

14、拖尾，但保留时间仍然过短 （vimin质的分离效果差，容易形成假阳性。如 果使用离子对试剂可以保证了液相色谱部分的目 标物出峰与杂质峰分离，但无法使用质谱进行测 定。最后选择HIL柱C不使用离子对试剂，可以在 有机相比例较高的条件下有稳定的保留时间2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量27（2m避兔）假阳性，且峰面积大大提高，降低了分别配制不同浓度的标准工作溶液进样分析三聚氰胺的检出限。相对于传统的普通高效液相（每个标准进样 3次，相对标准偏差小于3%即稳2009,8(3林荆等：

15、超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#（HPLC ）技术有了更高的分离效率快的出峰时间 和更高的灵敏度。2.2 前处理条件的选择在实验中，以95%乙腈水作为提取剂，不使用定），以质量浓度（ng/n为横坐标，峰面积为纵坐 标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，U PLCMS在质量浓度为 5一5 0“时相关!系数（f）C为9 9线性8良好。在空白鳗鱼中添加三聚氰胺2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#阳离子交换萃取柱净化，在均质时样品就容易黏附 成团无法提取完全，没有经过净化的提取液上机后 也会对离子源喷口造成污染，且存在基质抑制效标准溶

16、液（0 .0 2 5 m检测限为）,.05mg/kg （按信噪 比S/N计算）。2.4回收率与精密度2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#应，回收率低下且不稳定。三氯乙酸是酰胺类物质， 是可溶于酸性溶液的小分子，比较文献中植物源性蛋白质、畜禽产品或乳制品采用三氯乙酸、甲酸、盐酸溶液作为提取液 ：47采用浓度为1%的高氯酸溶 液就可以较好地沉淀水产品基质中的蛋白质，减少油脂干扰，获得较高的回收率和稳定性 。2.3工作曲线与检出限取鳗鱼、烤鳗、海杂虾空白样品各 5份，以0.0 0mg,（k.g5mg/（kg0mg/（k.g5mg/kg0. 5 0mg /按“

17、 1.”方法做回收率实验。每个添加浓度重复测定 6次，计算添加回收率和结果相对偏差，结果见表 3 UPLCMS分析的总离子流色谱 图和子离子流色谱图，见图1。2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#表3方法回收率和精密度(n=6)Tab 31Reecovep rr ieec si,as ifi ® ih es v(S1R6SampleLev amg/kgAverRecovery/ R/%RSD/%eel （鳗鱼）0.005., 10 02 5,0.5075858 2 8 57.2, 6.3, 4.5, 5.0ro ae sl t1(烤鳗)0.00

18、5., 0 02 5,0.50,637575, 804.2, 5.6, 5.0, 5.5seS1rimp(海杂虾)0.005., 10 02 5,0.50778586, 903.2, 5.2, 5.4, 4.52009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#2009,8(3林荆等：超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中三聚氰胺残留量#3结论参考文献1 FJDAIss tSetate onn£)ieth 好naon UMelamineFocCdontamiChaastti roonentero1ogy,2007,133图1鳗鱼样品中添加三聚氰胺（0.05 mg/kg）的总离子流色谱图和（b,c）子离子流色谱