WB操作-郭子龙

1、鉴于实验技术方法的改进以及试剂商品化程度的提高，本操作指南中的部分内容目前仅作参考学习，在实际实验过程中可能不会用到。一、实验原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。二、蛋白样品制备（根据样品及检测要求选适当提取方法，蛋白样品制备是WB的第一步，更是决定WB成败的关键步骤。）1. 样品与试剂组织(Storage: -80)；RIPA裂解液(强) (谷歌生物；beyotime:P0013B Storage: -20，一年有效。大瓶装买回来后及时用10ml EP管

2、分装，尽量避免过多的反复冻融。在分装的Ep管上标明分装当日日期，每使用一支要在EP管上做个标记，用完一支再启封新的。如果不嫌麻烦，初次分装RIPA裂解液时分装于10ml Ep管中，用于组织裂解；用于上样蛋白配制的分装一部分于1.5ml Ep管中。PMSF (谷歌生物；Solarbio: Cat.No.P0100 Lot.No.20150716 Storage: -20。100mM)10×SDS样品缓冲液量取下列试剂，置于10ml塑料离心管中1M Tris-Hcl，PH6.8 2.5mlSDS 0.5gBPB 50mg甘油 5ml加去离子水溶解后定容至10ml。小份（500l/份）分装

3、后，于室温保存。使用前将50l的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。2. 仪器与耗材组织蛋白：玻璃匀浆器；手术剪；冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。细胞蛋白：冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。3. 试验步骤A. 提取组织蛋白1) 台式离心机提前4预冷。冰上预冷PBS，冰上解冻RIPA裂解液（150-250ul裂解液/20mg组织）和PMSF需要冰上预冷几个这个要根据具体实

4、验来决定。EP管或离心管？2) 手术切除的组织块迅速置于预冷的PBS中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块（0.1-1g），置于组织匀浆器中。注意：组织不要剪太碎，一整块更容易匀浆。如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过振荡器强烈vortex使样品裂解充分。 3) 根据所需的量解冻RIPA裂解液，混匀，PMSF:RIPA=1:100，使PMSF的最终浓度为1mM，现配现用。（裂解液有毒）4) 按照每20mg组织加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。）5)

5、 用玻璃匀浆器匀浆5-20min直到组织充分破碎，然后冰上放置10-20min后，再匀浆5-20min，将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。注意：如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过振荡器强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如匀浆器裂解充分。6) 充分裂解后，10000-14000g4离心5min需要4度吗？需要已补充，取上清，-80冻存，避免反复冻融。（如需马上使用可以放于4或，-20可存放2-3月。，但不要太久最长多久？原则上-20是一个月，但是我跟蒋师姐都做过三个月的没有问题。）7

6、) 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。（注意：由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowrys法或者BCA法。)样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，常用蛋白浓度为3ug/ul。（注意：上样量一致跑出来的条带颜值高关于这一点，调浓度在实际过程中间如果样本数量较多可能会带来极大的工作量，而且一般调都是以最低浓度作为参照，所以我们实验室各课题组没有这个习惯，不影响实验结果分析。所以我就没有作为硬性要求写进来了。）B. 提取细胞蛋白（以六孔板培养的

7、细胞为例）1) 台式离心机提前4预冷。冰上预冷PBS，冰上解冻RIPA裂解液（150-250ul裂解液/20mg组织）和PMSF需要冰上预冷几个同上，要根据具体实验来决定。EP管或离心管？2) 将冰提前堆砌成一定坡度形状，细胞培养板斜置于冰上，用移液枪吸取六孔板中原培养基上清弃置，若需收集上清则用移液枪吸取大部分细胞培养基到相应EP管，3000rpm, 5min去除死细胞。（原则上要换tip头，相同细胞不换的话要打干净，且按照从低浓度到高浓度孔使用。）3) 用塑料吸管加预冷PBS到孔板中，盖上盖子摇晃轻柔冲洗2-3遍，用移液枪吸净残留PBS弃置。4) 根据所需的量解冻RIPA裂解液，混匀，PM

8、SF:RIPA=1:100，使PMSF的最终浓度为1mM后面的1mM,不懂？写错了，已修正，现配现用。（裂解液有毒）5) 快速加入RIPA蛋白裂解液（样品处理前3-5分钟加入PMSF至终浓度1mM终浓度是1mM，初始浓度是100mM。混匀）120l（视细胞数目而定，细胞少每孔可加100l，最多不超过150l）。加完后缓慢摇晃细胞板。6) 用细胞刮刮板，用200ml量程的移液枪吹打，吸取移至全新EP管中， 12000rpm×5min离心，取120l上清计量，余下的约5l测浓度。7) 准备沸水8) 将已计量上清与5×上样缓冲液按4:1充分混匀，煮沸10min后取出，室温冷却后1

9、000rpm瞬离30s， -20待用。可以自己配置10×上样缓冲液，用于样品蛋白浓度过低，迫切需要扩大上样样品体积、缩减上样缓冲液体积的状况。请查找，附在相应的试剂配制处。4. 注意事项1) RPIA裂解液的配方很多，关于裂解液的选择，一方面可以参考碧云天的相关网页选择合适的裂解液；另一方面也需要通过一些预试验来摸索最佳的裂解液。2) 用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S）测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白

10、浓度。3) RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属于正常现象。该透明胶状物质为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续试验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，就可以检测到这些转录因子。4) 离心力与转速需要换算。5) 尽可能提取完全或降低样本复杂度，只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；6) 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；7) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，所有步骤冰上进行，加入合适的蛋白酶

11、和磷酸酶抑制剂；8) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；9) 样品分装，长期于-80中保存，避免反复冻融。 三、制胶1. 相关试剂的配制：（相关试剂已全部实现商品化）1) 10%的SDS（戴口罩称取）：称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。4保存，如在长期保存中出现沉淀，可在30温水浴融化后仍可使用。2) 1.5M Tris/HCL（pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，4下保存。3) 0.5M Tris/HCL（pH6.8）Trisbas

12、e 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，4下保存。4) 30%丙烯酰胺/0.8%N,N-亚甲丙烯酰胺 丙烯酰胺（Acr）75g甲叉双丙烯酰胺2g加双蒸水150ml，37加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0，4棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。ttt丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。5) 10%AP溶液过硫酸铵 0.1g双蒸水 1ml配好后4保存，一个星期内有效。2. 制胶1)

13、取长短玻璃板，提前充分洗净后干燥箱中烘干。注意不要用清洁球之类的粗糙物品清洗玻璃板，可用洗洁精泡约2h，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，置于架子上晾干或干燥箱中烘干；2) 试剂提前从冰箱拿出平衡恢复到室温，否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡；3) 将长短玻璃板对齐后嵌入玻璃板槽中固定，后将固定好的玻璃板槽置于制胶架密封垫上，固定玻璃板槽，防止漏液。短板朝外，密封垫下滤纸的高度要合适，刚好齐平下面的凹槽最好。一般漏胶是因为长短板没有对齐，而不是因为下面垫的高度。分离胶15%分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶5%总体积10mL10mL10mL10mL3mLd

14、dH2O2.3mL3.3mL4mL4.63mL2.1mL30%丙烯酰胺(29:1)5.0mL4.0mL3.3mL2.67mL0.5mL1MTris-HCl (PH6.8)00000.38mL1MTris-HCl (PH8.8)2.5mL2.5mL2.5mL2.5mL010%SDS100L100L100L100L30L10%过硫酸铵100L100L100L100L30LTEMED5L5L5L5L3L最佳分离范围10-40 kD12-60 kD20-80 kD30-90 kD注意：要根据温度调整TEMED的使用量。夏天凝结的快，冬天凝结的慢。冬天如果凝结的慢，可以适当加大TEMED的用量扩大至1.

15、5-2倍。 4) 按上述配方配制分离胶，丙烯酰胺和TEMED最后加，每加入一种试剂都注意及时搅拌混匀，力度要适当不要弄出气泡。充分混匀后加入已固定密封长短玻璃板间，匀速加入避免气泡产生，加入的量略高于夹子的最高处（或者胶面升到绿带中间线高度时即可）。加好后均衡加入适量（1ml+）的ddH2O压胶，使胶面保持水平状态，等待约20-60min（根据室温而定）。一般可以依据剩下在离心管中的胶的凝固情况来确定胶的凝固。注意：胶通常在0.51h内凝集最好，时间过快胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平，封胶后切记勿动。5) 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝。当

16、分离胶与ddH2O形成清晰分界后，再等3min 使胶充分凝固弃除分离胶上层ddH2O，将配制好浓缩胶加至分离胶上层（加入的量要与玻璃板的最高线平行）。插上梳子（注意勿产生气泡），等待凝固。注意：浓缩胶的加入很重要，由于其硬度比分离胶小，而且还要加入梳子，掌握其凝固的时机很重要。太迟胶要粘住梳子，太早胶凝固不好。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中可以在两边补胶（补12 次就行了）。插这个补胶是在插入梳子之后。梳子时要使梳子斜着进入从左滑到右，插梳子要用力均匀，一次成型，且要注意梳子插入时哪面朝内哪面朝外。6) 隔天使用的话，将胶放置EP手套内，里面加

17、入适量双蒸水，放入4冰箱。ttt注意事项1) 不同公司的装置，制胶模具使用可能有所出入，需要按照实际情况而定，本指南按照Biorad公司的器材来编写的。2) 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。3) 胶的凝固很快，主要是加入TEMED后的动作要迅速，避免提前就在烧杯中就凝固了。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。四、电泳转膜1. 电泳1) 将玻璃板夹上电泳夹，长板对外，短板上沿要对齐电泳夹的凸线，快速准确地同时合上两边绿色的固定板。加入足量电泳液至两块板中，高度要漫过内侧的短板，进行验漏。确定不漏液后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻柔迅速将其拔出。电泳槽内

18、的电泳液加多少按照槽外的刻度线依板子数量而定，如果四块板子的话1L的电泳液可能还不够，可以用之前实验留下的电泳液补齐。2) 用微量进样针或加样吸头加入样品20-30g至加样孔中，若待测蛋白表达水平低可提高到50g。t将样品吸出时不要吸进气泡，加样器深入至加样孔2/3处，加样时保持针头位置不动，除非上样体积大那就边加边往外退。t加样速度要适中均匀，加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出，加样太慢可能发生弥散。t1.0十孔每孔最大上样量可达38l，1.0十五孔每孔最大上样量可达18l。t加入下一个样品前，进样器需在已备好的双蒸水中洗涤2-3次，以免交叉污染。t可在第一孔和最后一孔加2

19、0µl上样缓冲液以避免边缘效应，第二孔加3µl marker。Marker的选择要根据所跑的目的蛋白分子量决定。常用26616和26619，有大分子一般选用26619。3) 80mV恒压电泳，待样品通过浓缩胶压成一条线，同时marker开始分离后调整电压至120mV，密切注意观察溴酚蓝位置，其到达凝胶底部后停止电泳。如果是跑小分子蛋白、表达丰度低的蛋白、易分解蛋白，最好电泳时冰浴。4) 电泳期间可以配转膜液、准备冰、剪裁PVDF膜、活化PVDF膜等工作。大分子蛋白用0.45的膜，小分子蛋白（20kd左右往下走）用0.2的膜。t一般地剪裁PVDF膜时，比照梳子长度多剪一孔，要

20、在目的蛋白大小对应的marker位置往上下游分别多剪一个条带确定宽度，保证PVDF膜适度比实际胶块稍大。用中性笔在左上角做好标记，全程用镊子操作，且只接触膜的两侧最边缘的非蛋白印迹区，谨防蛋白污染。t在切胶前PVDF膜用甲醇活化（目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子蛋白转移时多加甲醇也是这个目的）。1×SDS-PAGE电泳缓冲液转膜缓冲液名称用量名称用量Tris碱3.2gTris碱3.06g甘氨酸20g甘氨酸14.4gSDS1.06g甲醇200ml加ddH2O定容至1000ml混匀加ddH2O定容至1000ml混匀，配好后提前预冷转膜缓冲液

21、。2. 切胶电泳完毕后，回收电泳液，只要不浑浊可重复使用2-3次。1) 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候要在自来水龙头下操作，水流大小适中，动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）。除长板后，可将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。将短板放置废弃的滤纸上，以白色滤纸做背景，切胶更方便。将胶保留在短板上可以保证从左至右的顺序跟上样顺序一致。2) 根据目的蛋白大小参照marker位置截取凝胶，可用切胶板或者洗干净的短长？胶留在短板上了。这里需要用一块新的短板板进行切胶，切胶手法尽量保证干脆利落，水平截取。3

22、. 湿法转膜1) 湿法转膜“三明治”从下往上的顺序依次为：()海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵()，蛋白带负电，膜要靠近正极。展开转膜夹放置瓷盘中，负极黑板在下，倒入适量转膜液，高度以刚好浸没负极黑板上的滤纸为宜。在切胶前由负极方向开始依次铺设海绵一块、滤纸六层，用玻璃试管或切胶板赶走滤纸中气泡。2) 将切好的目的条带凝胶放置黑板的滤纸上、已做好标记的PVDF膜覆盖在凝胶带上，注意将PVDF膜翻转过来使得带记号面紧贴凝胶，左上角的记号位置变成左下角。将一个板子上的全部条带和PVDF膜对应放置完毕后，用切胶板赶走存在于胶和膜之间的气泡，在此过程中需要有人在旁边不断地吸取转膜液滴加到胶和膜上，两者均

23、要一直保持湿润状态。3) 再将滤纸六层轻柔缓慢覆盖到PVDF膜上，尽量避免触动胶和膜使其错位，用玻璃试管平擀排出气泡后再将海绵覆盖到滤纸上，将正极白色板盖到海绵上，这一步要注意正极白色板左右要和负极黑色板左右对齐再固定转膜夹，以防止在夹紧转膜夹时使滤纸、胶或膜等相对位置挪动。4) 将转膜夹放置转膜槽内，夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。转膜缓冲液倒入转膜槽中，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。200mA恒流冰浴电泳，时间设置根据目的蛋白分子大小而定（100±kd 2.5h±、50±kd1.5h、20±kd 60min±）后停止。如

24、果一块板子中有需要提前拿出来的条带则注意在安排胶和膜的位置时尽量放到靠近开口的外侧，取膜时只用镊子揭开滤纸一角，夹住膜后轻轻水平抽出来即可，切忌动作过大影响到其他还要继续转膜的条带。5) 可以用丽春红（具体试剂名称可能记忆有误）染PVDF膜，看蛋白条带有否从胶转印到PVDF膜上，以验证转印是否成功。事后可以将丽春红洗去，继续后面的实验步骤。此法公卫劳动卫生实验室早已标准化，可以咨询这个步骤我们是知道的，但是参考意义有限吧。一般地，第一次曝某次蛋白的时候会用这个方法因为所有的条件都在摸索；对于经常做的蛋白或者已有人做过的蛋白，实验条件各方面都算是比较成熟了，所以我们一般都跳过此步骤。第二丽春红染

25、色的结果并非十分靠谱，表达丰度低的蛋白一般显示不出来。6) 封闭 ：将PVDF膜从夹中取出后，TBST漂洗5min将膜放入装有封闭液的圆皿中，摇床上常温摇动封闭1h。如果一抗为多抗或者前期实验显示曝光时有杂带，可以考虑4封闭过夜。t转膜期间可以配置TBST洗膜液和5%脱脂牛奶封闭液。PVDF膜封闭液:脱脂奶粉5g、TBST 100ml，室温搅拌20min（现配现用）。3%BSA稀释液：BSA 0.3g、 TBST 10ml充分混匀（现配现用）。TBST洗膜液名称用量NaCl8gKCl0.2gTris碱3gTween 201-1.5ml加ddH2O定容至1000ml混匀，调PH至7.4，一般地1L的TBST盲加1.1ml浓盐酸即可。4. 注意事项1) 避免用手直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；2) 用切胶板把玻板撬开时注意用力要轻以免损坏玻板；3) 把胶从玻板上剥离时要保持胶的完整性，转膜时胶和膜之间不能有气泡。若有气泡则可用切胶板轻轻赶走气泡；4) 转膜前胶要在转膜缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍于转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。5) 转膜液不能重复使用。6) 每启用一瓶甲醇注意写上启用人姓名、日期及标注“WB专用”