酶标记抗体的制备技术

1、 酶标记抗体的制备技术（一）酶标抗体的条件1纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。2特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。3效价高 一般琼脂扩散鉴定为164以上才算合格。抗体的可供标记的位点结构图（二）酶标记方法1交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm3时，即为好的交联剂。戊二醛交联法又分为一步法和二步

2、法。 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体戊二醛或抗体戊二醛抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作： 抗IgGAKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4充分透析或以SephadexG25柱除去

3、过量的戊二醛，4保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)； 抗IgGHRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：a) 将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以

4、SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。b) 加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。c) AKP一般不采用二步法,而只用一步法。改良HRP二步标记法：a) 取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37温育2h后加入冰冷的分析纯的无水

5、乙醇2ml，2500r/min离心沉淀10min15min，倾去溶液。b) 沉淀以80%乙醇4ml5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。c) 沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。2氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体（1）氧化法操作过程如下： 将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1

6、%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。 在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg抗体(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。（2）改良过碘酸钠法： 取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中

7、，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置430min； 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min； 加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合； 加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置42h； 在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，430min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液

8、体在4透析除盐过夜； 次日取出离心，以除去不溶物，即得酶抗体(HRPIgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。戊二醛交联法与过碘酸钠氧化法比较，见表123。表123 戊二醛法与过碘酸钠法比较比较项目戊二醛法过碘酸钠法一步法二步法标记方法简单较复杂较复杂酶利用率24%24%70%酶偶联到99%抗体上产率5%5%50%标记抗体分子量750万25万40万穿入组织能力差好一般抗体活性丢失多少较多酶活性丢失多少较多染色效应差较好较好3二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先

9、用巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N苯二马来酰亚胺活化，然后除去多余的试剂，最后使含二马来酰IgG与含硫基的半乳糖苷酶连接。具体操作如下： 将Ag/Ab溶于0.1mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质, Ag/Ab (14mg/2ml)与10ml -巯基乙胺在37温育90min。 过Sephadex G25后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原Ag/Ab。在0,按11滴加饱和N、N-O-苯二马来酰亚胺溶液混合，于30温育20min，过SephadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺。 收集二马来酰亚胺“活化”的Ag/Ab浓缩使浓度为OD280nm

10、=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20l(5mg/ml)-半乳糖苷酶，置3020min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4置24h72h，再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4保存备用。4.酶标记半胱氨酸方法试剂：马来酰亚胺结合缓冲液: 含10mM磷酸氢钠, 10mM EDTA的PBS，pH 7.0。抗体或抗原：溶于PBS浓度达5mg/ml。步骤：1.用2-MEA还原Ag/Ab产生巯基1) 取100l的马来酰亚胺结合缓冲液加入6mg 2-巯基乙胺(2-MEA)的EP管中；2) 加准备好的Ag/

11、Ab5mg到2-MEA溶液37温浴90min；3) 溶液降温到室温，用PBS超滤离心透析脱盐除去2-MEA。Note: Separation of 2-MEA from reduced IgG is critical, as residual 2-MEA will interfere with coupling. To determine if adequate separation has been achieved, perform a BCA Assay to identify location of 2-MEA (See the Additional Information Secti

12、on).4)包含还原态Ag/Ab的液体浓度约2.5mg/ml，立即进行下步反应减少二硫键形成。Note: To precisely determine protein concentration, use the Coomassie Plus - The Better Bradford Assay Kit (ProductNo. 23236).2. 准备马来酰胺：HRP1) 称取1.067mgHRP对每毫克的巯基化抗体；2) 加1.1mg巯基-SMCC每毫克HRP；3) 加PBS使HRP终浓度为8mg/ml；4) 磁力搅拌混合2h；5) PBS平衡柱除盐HRP，收集第一个峰；3.抗体：HRP连

13、接反应1) 按1mgHRP每毫克Ag/Ab立即混合HRP与巯基化Ag/Ab，室温孵化1h；2) 在2-8混合16-20h；3) 对PBS透析换3次液，每2h换一次液；4) 加储存Buffer或等量无菌甘油稀释2倍-70保存。马来酰亚胺活化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联活化的酶与含SH-的抗原/抗体的标记过程（一） 酶标抗体结合物的纯化 在酶标记的溶液中，出现的是各种交联物的混合物,有酶抗体、酶抗体酶、抗体抗体、酶酶，甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体酶和酶抗体酶外,其它都应该给予除去。1 50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对

14、酶标抗体的损耗少。2 过SephadexG200或Sepharose6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。（三）酶标抗体的鉴定1 酶标抗体的活性鉴定 一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1：16以上。2 酶结合物的定量测定 包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。酶量( µg/ml)=OD403nm×0.42 （1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD2

15、80nmOD403nm×0.42)×0.94×0.62(OD403×0.42为酶在403nm的光密度，抗体与酶戊二醛结合后OD280nm约增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg，所以又乘以0.62)。（2）过碘酸钠法：IgG(mg/ml)=(OD280OD403×0.30)×0.62(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。 酶标记率：OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(40

16、3nm)与抗体酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。3酶结合物的质量标准 纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。（1）酶的催化活性。（2）免疫学活性。（3）未联接的游离酶的量。（4）未联接的原始免疫反应物的量。（5）每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。（6）生化性质。（7）酶标记免疫试验效果。酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRPIgG结合物进行酶标记免疫试验，可得到不同的试验结果，故应予重视。用于ELISA的各项指标参数见表1240表124 用于ELISA酶标抗体的各

17、项指标参数评价最好好一般酶结合量(mg/ml)1.00.50.4酶结合率(%)309107酶IgG克分子比1.51.00.7（五）酶标抗体的保存分装小瓶，冻干低温保存。也可分装小瓶,在4或0以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期：一般12年活性不变。抗原/抗体的ELISA/WESTERN检测The pipted conjugated to hoseradsh perxdaseThe following 5 steps of preparation are carried out in labeling an immunoglobulin (IgG) w

18、ith horseradish peroxidase (HRP): (i) oxidation of HRP with NaIO4 ; (ii) crosslinking of HRP (ox.) with 1,13-diamino-4,7,10-troxatridecane (DTT); (iii) coupling of IgG with crosslinked HRP; (iv) stabilization of the azomethine bonds; and (v) S-300 gel permeation chromatography. Steps (ii) and (iii)

19、are carried out in connection with the method of the present invention. They are described in detail by the example of the HRP-labeling of IgG (rabbits) with 1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecane. Therefore, steps (i), (iv) and (v) which are only indirectly connected with the present invention and are

20、 generally known, are described here only briefly. (i) Oxidation of HRP with NaIO4 4.0 mg of horseradish peroxidase (HRP, 100 nmole) are weighed in a reaction tube, dissolved in 0.8 ml of water and 0.2 ml of freshly prepared 0.1 M of NaIO4 solution is pipetted into the copper-red HRP solution, the c

21、olor of which changes to black-green. The reaction tube is placed immediately into an enclosure which is closed to avoid exposure to light. The reaction time totals 15 min. at room temperature, with an occasional moving of the tube. 50 l of ethylene glycol are added to avoid an excess of NaIO4. This

22、 quenching is also carried out in the dark and the reaction time totals at least 30 min. Thereupon, the HRP (ox.) solution again becomes copper-red. The separation of HRP (ox.) from low-molecular reactants is effected by gel filtration in the exclusion volume of a Sephadex-G 25 column (approx. 30 cm

23、 long, 12 ml of gel bed volume). It is sufficient to take 20 fractions per 0.5 ml. The red-brown HRP containing fractions are pooled and are evaporated by ultrafiltration (10,000 NMGG) to a volume 0.5 ml. (ii) HRP (ox.) Cross-linking with DTT in the Event of an Equimolar Batch 10 ml of DTT (=1.005)

24、are pipetted into a 50 ml measuring flask, that is filled to the mark with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8). This DTT solution can be used for more than 2 months. 0.1 ml (100 nmole) of this solution are pipetted into the HRP (ox.) solution concentrated by evaporation. A microstirrer is inserted to

25、mix the reaction solution rapidly and thoroughly. The reaction time for crosslinking totals 4 hours at room temperature; if needed, the reaction mixture may also be placed into a refrigerator overnight. (iii) IgG Coupling with Crosslinked HRP The stoichiometric ratio between crosslinked HRP and IgG

26、should suitably be about 5:1 to obtain a high degree of substitution. 15 to 16.7 nmole are used for coupling in view of an insignificant loss of HRP in the 1st and 2nd preparation stages 2.25 to 2.50 mg of IgG (rabbits). Immunoglobulin is either directly inserted into the reaction tube which contain

27、s the crosslinked HRP solution in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8), and dissolved by stirring, or is earlier dissolved in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8), and is then added. During IgG coupling the reaction conditions are the same as during crosslinking reaction at room temperature either for 4 h

28、ours or the coupling mixture is placed into a refrigerator overnight. The reaction volume should not exceed 0.8 ml. (iv) Stabilization of the Azomethine Bonds 50 l 2 M of triethanolamine (pH 8.0) are added to the coupling solution, the reaction mixture is thoroughly mixed and cooled in a refrigerato

29、r. 0.2 M of NaBH4 solution are prepared for hydration of the azomethine bonds, with 8 mg NaBH4 dissolved in 1.0 ml cold water only immediately before being used. Not more than 75 l of this solution are added to the coupling solution. When stirring it the reaction solution foams vehemently. The react

30、ion time totals approx. 30 min. in the refrigerator before 25 l 2 M of triethanolamine (pH 8.0) are added. The reaction mixture is placed into a refrigerator for another 2 hours. Finally, still 10 l 1 M of glycine (pH 7.0) are added for stabilization. (v) S-300 Gel Permeation Chromatography The HRP

31、tracer is separated in a 75 cm long Sephacryl-S 300.RTM. column (approx. 41 ml of gel bed volume) which is eluted with 0.05 M of PBS buffer/0.15 M of NaCl (pH 7.4). 35-40 fractions of 1.0 ml each are taken off. Only the fractions with high extinctions at 402 nm showing the most favorable properties

32、as to their specific and nonspecific bonds in EIA, at most only 3 tubes, are pooled.酶标记抗体HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取

33、纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高。HRP是一种

34、分子量44 kDa的糖蛋白，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，中性糖和氨基糖约占18，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由多个同功酶组成，等电点为PH59,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。但可以以纯酶溶液在10m

35、m光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度1(W/V)酶溶液吸光度为22.5，浓度为227umol/L。纯HRP干燥贮存于20可保持稳定，使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。氰化物或硫化物在105106mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用；氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3molL浓度时抑制HRP；HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地

36、抑制。强酸也是HRP的强烈的抑制剂。因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。HRP的同工酶主要可分为三种类型：含糖量高的酸性同工酶。等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。含糖量低的碱性(PI>11)同工酶。酶免疫试验中所使用的HRP，以PI为8.79.0的所谓“C”同工酶为主要组成成分，其他同工酶的活性则很低。“C”同工酶的共价结构由2个密切接近的区域组成，血红素基团则位于其间而成夹心结构，糖链以8个不同的部位结合于多肽。天然的酶所带的纯电荷极少；无游离

37、的氨基，仅有2个可测出的组氨酸，6个赖氨酸似乎全被糖链外壳所遮盖。因此，HRP一般仅有12个可用于耦联的氨基。HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:HRPDH2H2O2D2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应

38、中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达

39、高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。(二)HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标记步骤：(1)称取HRP 25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至

40、5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3

41、.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mgml)OD403nm×0.4IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量克分子比值 ÷ × 440,000 160,0

42、00IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25戊二醛液：取25戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫

43、酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9)HRP(RZ>3.0)。(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和Ig结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的-和-氨基以避免酶分

44、子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5

45、mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH4液，混匀，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: 0.2M NaAc (1.361g/50m

46、l) 3.7ml，0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml，加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO3 0.32克，NaHCO3 0.586克，加蒸馏水至50ml，再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH4溶液(4mgml):临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度

47、过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10gml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1BSA-PBS液依次稀释成1100，1200，1400，1800，11600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37孵育1小

48、时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，371030分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。(四)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高

49、,效价高(最低116),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4.浓的标记物相当稳定，常加入3040甘油于-10下保存。4可保存12年，但稀释成110，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。氧化法采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成

50、醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30mol/L pH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L 0.08 Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)待标记蛋白，室温置2h3h，加入5mg NaBH4，于

51、4冰箱放3h或过夜，然后用PBS液透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。改良过碘酸钠法：取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4 30min； 取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O 0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置42h；在以上溶液中缓慢加

52、入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶抗体(HRPIgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。标记注意事项：1. 抗体或酶标蛋白样品与结合反应用的Buffer的pH值不同：酶HRP的结合反应在基础pH Buffer中最有效，溶解样品Buffer可用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.3)或0.04M硼酸钠盐缓冲液(pH9.3-9.5)，其他缓冲液如0.1M磷酸钠盐缓冲

53、液(pH7.4)也可以制备少量分子的结合。2. 抗体或蛋白样品中含有带氨基的化合物如Tris、甘氨酸、NH4OH、尿素等影响有效的结合反应：标记前通过对酶标缓冲液透析除去这些杂质。3. 酶标记物分子特别大：减少标记反应时间；标记反应在低温下进行同时改变标记时间；调整标记蛋白与HRP的分子比例到最佳；在中性pH值如含0.1MNaCl的0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.4)中进行连接反应。NaIO4法HRP标记抗原方法标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌30分钟。(3) 加入0.4ml新配的0.2mol/l乙

54、二醇室温避光继续搅拌半小时(可省略)。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析4过夜。(4)加10l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.09.5，立即加入5mg溶于0.01M碳酸盐缓冲液的抗原，室温避光轻轻搅拌3小时，然后置4冰箱4h。(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4终止反应磁力搅拌1h，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4 PBS透析，4过夜。(7) 取出透析过夜的酶标抗原测定体积加入BSA至终浓度1-2mg/ml，混匀再加入1/2体积甘油混匀-20度冻存，并测定活性。注：保证抗原与HR

55、P摩尔比为1:1.HRP分子量约40kDa，等电点为PH7.2，在PH3.5-12均较稳定，6315分钟，室温数周、甲苯和苯类溶剂处理都不影响它的活性。碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶，分子量为82 kDa。标记HS-巯基的酶联反应方法试剂：1PBS，2. PBS: 0.05M EDTA，3. PBS: 0.01% thimerosal，4. Conjugate Storage Buffer，5.SATA，6. DMF，7. Hydroxylamine hydrochloride，8. NaOH Pellets，9. PD10 Column or Sephadex G25，10. Sulfo-S

56、MCC准备巯基化抗体：1. 浓缩抗体到5-7mg/ml;2. 取10mgSATA溶于1ml DMF；3. 按3.0ml SATA:DMF每毫克抗体混合；4. 室温轻轻搅动溶解混合2h；5. 取0.5氯化羟胺ghydroxylamine hydrochloride溶于10ml的PBS:EDTA；6. 加0.25g NaOH调节以上溶液pH=7.0；7. 加入抗体溶液6.49ml/mlSATA；8. 轻轻室温搅拌溶解30min；9. 用PBS:EDTA平衡柱；10. 在柱上过滤除去巯基化抗体中的盐。收集尽可能少体积不含SATA，将SATA流穿出柱；11. 保存巯基化抗体于2-8度超过1h；12. 用PBS重新平衡柱。准备马来酰胺：HRP6) 称取1.067mgHRP对每毫克的巯基化抗体；7) 加1.1mg巯基-SMCC每毫克HRP；8) 加PBS使HRP终浓度为8mg/ml；9) 磁力搅拌混合2h；10) PBS平衡柱除盐HRP，收集第一个峰；准备抗体：HRP连接5) 按1mgHRP每毫克抗体立即混合HRP与巯基化抗体；6) 在2-8度混合16-20h；7) 对PBS透析换3次液，每2h换一次；8) 加储存Buffer稀释2倍保存。酶标记半胱氨酸方法二试剂：PBS: Dissolve the dry-blend