转染一般疑难解答

1、一 般 疑 难 解 答问 题可能原因解决建议转染效率低没有使用优化的阳离子脂质体试剂。选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。参见附录A或我们公司网站（）上“Transfection Collection”中的参考文献列表。没有使用优化条件。优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。参见第7章优化步骤。参见我们的网站（在Tech-online分子生物学部分）上的细胞特异性的转染步骤。DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。在复合体形成时不要使用血清。OPTI-MEM I培养基和DMEM是用于复合体形成的较好的培养基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合

2、物。注意：不要将OPTI-MEM I培养基用于LIPOFECTAMINE PLUS试剂或昆虫细胞。对于Sf9和Sf21细胞，Sf-900 SFM会得到最佳结果。存在抑制剂。不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。不恰当的细胞密度。细胞密度应该在转染时融合度为70%-90%。转染DNA的启动子-增强子没有被宿主细胞识别。确保转染DNA的启动子-增强子同目的细胞类型兼容。阳离子脂质体试剂冻结。不要使用冻结的或储存温度低于4的阳离子脂质体试剂。转染分析的问题。转染分析中加入阳性对照。质粒纯

3、化的问题。请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55的水浴上保温5分钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。细胞死亡率高。DNA量太高。作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。在剂量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调优化方法。阳离子脂质体试剂量太高。作一个剂量

4、-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入DNA，因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调优化方法。在转染过程中使用抗菌素。在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。细胞太少。作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。在无血清条件下细胞活性降低。使用OPTI-MEM培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用5%到10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。阳离子脂质体试剂氧化了。不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成

5、阳离子脂质体试剂的过氧化物。对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。注意：在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。存在过剩的EDTA。使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度<0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量（参见表5）。转染重复性不好。转染时的融合度波动。在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。在培养中细胞发生变化

6、。如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。针对不同阳离子脂质体的疑难解答CELLFECTIN试剂或DMRIE-C试剂问 题建 议试剂溶液混浊。这是正常的。确保在转染吸取液体前混合试剂（颠倒5到10次）。LIPOFECTIN试剂问 题 建 议未稀释的试剂即混浊。不要使用。可能已冰冻或在低于4保存。试剂稀释后混浊。这是正常的。未稀释的LIPOFECTIN试剂是澄清的。当稀释于OPTI-MEM时会变混浊。转染效率低。在加入DNA前将LIPOFECTIN试剂在OPTI-MEM（或其他无血清培养基）中温育30分钟。LIPOFECTAMINE试剂问 题 建 议荧光背景。在

7、免疫细胞化学转染后会检测到荧光背景。LIPOFECTAMINE试剂本身没有荧光。LIPOFECTAMINE PLUS问题 可能原因解决方法转染效率低试剂的加入顺序不对。将DNA和PLUS试剂在稀释培养基中混合，然后将混合液同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合。在复合前稀释的DNA或PLUS没有充分混合。确保在混合前每孔都混合好。在进行预复合的稀释培养基中加入DNA和PLUS试剂的顺序不影响转染活性。没有使用LIPOFECTAMINE试剂。确保在加入到细胞前将DNA-PLUS试剂复合物同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合并温育。LIPOFECTAMINE 2000问 题 建 议转染效率低。对于在OPTI-MEM中制备的稀释液，确保稀释的LIPOFECTAMINE 2000在30分钟内同稀释的DNA混合。如果使用D-MEM做为稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合细胞密度对于转染太低。在转染时细胞融合度应为90%。复合物溶液混浊。这是正常的。Table 5ReagentCationic Lipid Reagent(µg/ml)DNA(µg/ml)CELLFECTIN Reagent20020DMRIE-C Reagent20020LIPOFECTIN R