脓毒症小鼠肝损伤时的粘附分子基因表达

1、脓毒症小鼠肝损伤时的粘附分子基因表达【摘要】目的探讨脓毒症小鼠肝损伤时肝窦内皮细胞粘附分子基因表达变化。方法用盲肠结扎穿孔(CLP)法制造小鼠脓毒症模型，假手术组(sham)接受同样的手术操作但不行CLP。分别在致伤后3、12h分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法定量检测E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的基因表达，同时还测定了肝组织中MPO活性及微血管通透性的改变。结果CLP后3h肝窦内皮细胞E-selectin基因的表达明显增高（0.850.06 vs. 0.220.04, P0.01）；ICAM-1基因的表达在CLP后3h即明显增高12h时达高峰（1.020.10 vs.

2、 0.300.04, P0.01）；VCAM-1基因的表达在CLP后3h即明显增高（1.040.14 vs. 0.370.04, P0.01），至CLP后持续到12h后肝组织中MPO活性在CLP后3h明显增高（0.5890.116 vs. 0.1600.025, P0.01），持续到12h。CLP后3h肝微血管通透性即开始升高，至12h时与sham组比较差异有显著意义（0.0490.007 vs. 0.0340.004, P0.01）。结论脓毒症小鼠肝窦内皮细胞粘附分子表达增高可能是导致白细胞在损伤组织局部聚集进而造成器官功能损伤的重要因素。【关键词】脓毒症；内皮细胞生长因子；胞间粘附分子 A

3、 study on the adhesion molecules gene expression in murine sepsis induced liver injuryWU Rongqian, SONG Xuhua, XU Yingxin, et al. (Institute of Surgical Research, General Hospital of PLA, Beijing 100853,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the adhesion molecules gene expression in murine sepsis i

4、nduced liver injury. Methods Sepsis was induced in mice by cecal ligation and puncture(CLP). Sham operation group was used as control. The gene expressions of adhesion molecules (E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1) in liver sinusoidal endothelial cells were assessed by RT-PCR. Changes of MPO and microcir

5、culatory permeability in the liver were measured. Results A significant increase in E-selectin gene expression was observed at 3 hours after CLP 0.850.06 vs. 0.220.04 （P0.01）. And the gene expressions of ICAM-1 and VCAM-1 significantly increased between 3 and 12 hours after CLP 1.020.10 vs. 0.300.04

6、（P0.01）,and 1.040.14 vs. 0.370.04（P0.01）. A significant increase in hepatic tissue MPO was also found between 3 and 12 hours after CLP 0.5890.116 vs. 0.1600.025 （P0.01）.The microcirculatory permeability in the liver began to increase at 3 hours after CLP, and this increase became significant at 12 h

7、ours after CLP 0.0490.007 vs. 0.0340.004 （P0.01）. Conclusion The up-regulation of the gene expressions of adhesion molecules in liver sinusoidal endothelial cells may lead to the recruitment of leukocytes at the site of inflammation causing liver injury during sepsis.【Key words】Sepsis；Endothelial gr

8、owth factors； Intercellular adhesion molecule-1为脓毒症及其并发的多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的防治，本研究在制造小鼠脓毒症模型后直接分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法检测了肝窦内皮细胞中粘附分子E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的基因表达。材料与方法一、脓毒症模型制作及分组选用雄性昆明小鼠，体重1822g，由解放军总医院实验动物中心提供，随机分为两组：盲肠结扎穿孔组（cecal ligation and perforation,以下简称CLP组）和假手

9、术组（以下简称sham组），设两个时间点（3、12h）每时间点6只。二、肝窦内皮细胞分离按Braet等1的方法稍加修改分离肝窦内皮细胞。简述如下：肝脏经门静脉灌注、胶原酶消化后，以percoll梯度离心及选择性贴壁纯化肝窦内皮细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1106/ml。分离所得的细胞经台盼蓝染色检测其存活率，并经第因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，测定其纯度。三、粘附分子基因表达检测采用异硫氰酸胍一步法提取肝窦内皮细胞中的总RNA，紫外分光光度计定量，取1g RNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以-actin或2-MG为内对照基因扩增粘附分子基因。所用引物序列如下：-actin (478b

10、p): 5AGG GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA 3, 5ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC TGA 3;2-MG (300bp): 5GGC TCG CTC GGT GAC CCT AGT CTT T 3, 5TCT GCA GGC GTA TGT ATC AGT CTC A 3; VCAM-1 (442bp): 5CCT CAC TTG CAG CAC TAC GGG CT 3, 5 TTT TCC AAT ATC CTC AAT GAC GGG 3; ICAM-1 (326bp): 5TGC GTT TTG GAG CTA GCG GAC CA

11、 3 5 CGA GGA CCA TAC AGC ACG TGC AG 3; E-selectin (435bp): 5CCT GAA CTG CTC CCA CCC GTT CG 3, 5 GTG AAG TTA CAG GAT GAC TTA AAC GCA 3。 PCR反应体系为25l，反应条件：95变性5?min后，按94 30?s, 55 30?s, 72 90?s, 扩增30个循环，最后72延伸10?min。取PCR反应产物10?l在1.5琼脂糖凝胶中电泳，用pBR 322/Hinf做分子量标准来判断PCR产物片断大小，溴化乙啶染色，紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量，以目

12、的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。四、肝组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase enzyme, MPO )活性检测2结果一、肝窦内皮细胞鉴定、纯度及存活率分离所得的肝窦内皮细胞经台盼蓝染色显示存活率大于90%，经因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，因子相关抗原阳性细胞比例大于85。二、肝窦内皮细胞粘附分子基因表达CLP后3?h肝窦内皮细胞E-selectin基因的表达明显增高（P0.01），至12?h时明显降低与sham组比较差异无显著意义； ICAM-1基因的表达在CLP后3?h明显增高（P0.01），至CLP后12?h其表达进一步增高（P0.01）。VCAM

13、-1基因的表达在CLP后3h明显增高（P0.01），至CLP后12?h其表达虽有所降低但仍明显高于Sham组（P0.01）（见表1）。三、肝组织MPO活性CLP后3?h肝组织中MPO活性即明显增高，与sham组相比差异有显著意义（P0.01），至12?h时虽明显降低（P0.01）但与sham组相比差异仍有显著意义（P0.01）（见表2）。四、肝微血管通透性CLP后3?h肝微血管通透性即开始有所升高但与sham组比较差异尚无显著意义，至CLP后12?h肝微血管通透性明显增高与sham组比较差异有显著意义（P0.01）（见表3）。讨论在脓毒症时肝脏常常受累。内皮细胞表面粘附分子表达的增高在其中具有

14、重要作用。内皮细胞表面的粘附分子主要有E-选择素(E-selectin)、ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) 和VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1)。E-selectin属选择素家族，它在白细胞沿血管内皮细胞的滚动、着边及早期粘附中起主要作用。ICAM-1与VCAM-1属免疫球蛋白超家族类（immunoglobulin superfamily），它们作为白细胞表面粘附分子-整合素的配体，在白细胞与内皮细胞的后期牢固性粘附及穿越内皮细胞迁移的过程中起关键性作用3。白细胞粘附并穿越血管内皮细胞是由以上

15、粘附分子按顺序协调控制的。组别鼠数E-selectinICAM-1VCAM-13h12h3h12h3h12hsham组60.220.040.230.040.260.030.300.050.370.040.300.05CLP组60.850.060.240.030.670.041.020.101.040.140.860.05 注：CLP组与sham组比较P0.01 组别鼠数3h12hsham组60.1600.0250.1560.021CLP组60.5890.116?0.2680.036 注：CLP组与sham组比较，P0.01;?3h CLP组与12h CLP组比较，P0.01 组别鼠数3h12h

16、sham组60.0390.0040.0340.004CLP组60.0410.0060.0490.007 注：CLP组与sham组比较，P 0.01 就目前报道所见，对内皮细胞粘附分子的研究多是通过体外细胞培养或原位组织切片进行的，但体外细胞培养与活体实验毕竟存在差异，而原位检测则不易准确定量。我们在制造小鼠脓毒症模型后直接分离肝窦内皮细胞，定量检测了多种粘附分子的基因表达变化。结果表明，CLP后肝窦内皮细胞E-Selectin、ICAM-1和VCAM-1多种粘附分子的基因表达均明显增高。对粘附分子高表达带来的后果，即白细胞在局部组织中的聚集，我们也进行了相关的研究。中性粒细胞中存在有MPO，且

17、每个细胞所含MPO的量是一定的，约占细胞干重的5%，因此可以通过测定MPO的活力来推算中性粒细胞的数量。这种方法与普通病理学切片中进行中性粒细胞计数的方法比较具有定量准确的优点2。我们的结果显示：在脓毒症早期肝组织中MPO活性即明显增高，到脓毒症晚期虽显著降低但仍明显高于sham组。这表明脓毒症时中性粒细胞在肝组织中的浸润明显增加。当中性粒细胞到达组织细胞周围后可通过释放氧自由基、胶原酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、蛋白水解酶及脂类代谢产物等造成微血管通透性的增高和组织细胞的损伤。我们的研究也证实CLP后肝脏微血管通透性明显增高。粘附分子的过高表达是MODS时导致器官功能损伤的重要步骤，也是治疗时

18、可以加以阻断的步骤。粘附分子单克隆抗体可以直接阻断粘附分子的作用，通过减少白细胞的聚集来减轻组织器官的损伤。但粘附分子本是机体正常炎症反应的一个重要参与成分，外源性的干预完全阻断它们的作用必将使机体正常的炎症反应遭受破坏，因此我们认为，在适当时机在基因水平调节它们的表达而不是完全阻断它们的作用可能对机体更为有利。基金项目：国家自然科学基金（39870796）作者单位：吴荣谦（北京，中国人民解放军总医院普通外科研究所100853）宋旭华（北京，中国人民解放军总医院普通外科研究所100853）徐迎新（北京，中国人民解放军总医院普通外科研究所100853）孟宪钧（北京，中国人民解放军总医院普通外科研究所100853）参考文献1Braet F, De Zanger R, Sasaoki T, et al. Assessment of a method of isolation, purification, and cultivation of rat liver sinusoidal endothelial ce