western blot 相关试剂及步骤

1、western-blot-相关试剂及步骤Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒 一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL 离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）：1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗 心脏约100mg，排除血液，放入离心管，投入 液氮中3、组织于-80摄氏度冻存 二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离 心机、 RIPA蛋白裂解液 （Radio Imm unop rec ip itatio n Assay，详见下载的网页）Ph

2、enyl metha nesulfo nylfluoride（碧云天公司）、 PMSF（ Phenylmethanesulfonylfluoride ， 苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978,Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70乙醇、一管三蒸水；取 出RIPA和PMSF军冻2、按照 1mL PIRA: 10uL PMSF: 100mg 组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70乙醇、一管三蒸水的顺序 依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织， 上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间 保持一致。当出现大量

3、泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm, 4摄氏度，30分钟300uL上清-80摄氏6、先取100uL上清于离心管，再取 于离心管。前者用于测试，后者备用 度冻存。需分装-80注意：购置的RIPA不宜反复冻融， 摄氏度保存；P MSF为晶体状，购置后按照说明 书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存 三、蛋白上样量定量采用 BCA法测蛋白（BCA protein assay kit ，Thermo Scie ntificProd 号 23225，详见下载的网页，Thermo Scientific ）: （一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的 RIPA

4、蛋白裂解液（二）步骤1、 详见 BCA Protein Assay Kit.pdf使用说明 书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。（加好各试剂，混合于37摄氏度放置30分钟）2、使用 Amersham Biosciences GeneQuant Pro 分光光度计的562nm测试，读数三次，取平均 值（ug/mL）四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（各浓度的配制 见配方表）SDS-PAG试剂配制1）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 （Acrylamide ）29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide ）1.0gdddH2O , 37°C溶解，定容至 100ml,棕色瓶存于4C

5、。2) 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-Hcl(PH 8.8 )Tris18.15g1mol/L HCL调节PH （可以使用分析纯级别的浓盐酸，下同）dddH2O 定容至100mL 4 °C保存3）浓缩胶缓冲液 1.0mol/L Tris-Hcl （PH6. 8 ）:Tris12.1g1mol/L HCL调节 PHdddH2O 定容至100mL 4C保存4）10% SDS 溶液：SDS 10.0g dddH2O定容至100ml,室温保存5）10%过硫酸铵（AP）:过硫酸铵 0.1g dddH2O定容至1.0ml , 4C保存，要在一周内使用，最好新鲜配制6）TEMED遮光保

6、存，分装于EP管冻存五、电泳（一）器材和试剂准备：电泳仪、电磁锅、浮板、离心机、1.5mL离心管、）、Marker、5X上样缓冲液（loading buffer生理盐水、电泳液5X SDSPAGE Loading Buffer (20mL体系总体积)DTT (DL-Dithiothreitol配制方法二硫苏糖醇）（0.1M）1.54gdodecylsulfate )SDS ( sodium2.0g1M Tris-CL (p H6.8) 8.0mL溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至 20mL）步骤1、电泳上样体系总 25uL （即每孔加25uL） （下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂）Ma

7、rker管（泳道）蛋白样品管（泳道）空白管（泳道）蛋白无?无5X loading buffer5uL5uL5uLMarker7uL无无生理盐水13uL补齐至25uL20uL体系总体积25uL25uL25uLMarker 条带依次是 仃0、130、95、72 （red ）、 55、43、34、26、17、10 （green ） KD大小的梯 度。蛋白样品管的上样量的计算：40ug （这个值 不一定的，可以根据算出的体积来改变。比如超 过20uL则需要减少上样量。而且如果内参不齐 时也需要调整）除以依据分光光度计的读数算出 的蛋白浓度ug/mL（根据说明书蛋白以1: 20被 稀释），再转换成uL的

8、单位。空白管的设置是因为，当蛋白样品少于9个 样品时，空出的孔需要加入物质，以免蛋白跑偏。2、根据上表加好各试剂后，于 270摄氏度水浴 5分钟，离心，再上样，倒入电泳液3、层胶80V跑，下层胶120V跑（一般至少1 个半小时） 六、转膜（一）器材和试剂准备：电转仪、电转液、冰块（二）步骤1、准备夹板、滤纸、NC膜（浸泡于电转液）2、取出凝胶切下蛋白和marker所在的凝胶，制 成由下到上依次是：滤纸、凝胶、 NC膜、滤纸 的夹板。放置各层时注意要加电转液湿润并排出 气泡，以免干扰电转效果。3、放入电转仪，加入冰块和电转液，300mA恒流 电转1小时。七、封闭（一）器材和试剂准备：丽春红染料、

9、脱脂牛奶、TBST塑料盒、镊子、 剪刀、摇床（二）步骤1、取出夹板，用镊子夹出NC膜置于丽春红染料中3-5分钟2、取出NC膜可以观察一下条带是否均匀、 有无 跑偏，用剪刀剪去周围空白，并在左下角剪一斜 角。用蒸馏水洗去丽春染料。3、TBST配置5%脱脂牛奶，放入NC膜于摇床上慢 摇1小时八、抗孵育（一）器材和试剂准备：塑料膜、封塑机、一抗、TBST（二）步骤1、根据NC膜的大小剪出一张双层的塑料膜，取 出NC膜置于塑料膜中，封闭塑料膜的三边，制 成一个袋子2、按照一定比例稀释一抗后，加入塑料膜袋，寸闭塑料膜开口排气泡，3、NC膜正面朝下，放置于慢摇的摇床 30分钟, 再放入4摄氏度的慢摇摇床过

10、夜 九、二抗孵育（一）器材和试剂准备： 二抗、TBST剪刀、摇床（二）步骤1、取出NC膜于常温慢摇的摇床30分钟， 剪开塑料膜，用TBST洗涤3次每次10分钟（调节摇床至快摇）2、按照说明书准备二抗的稀释液，一种是 目的蛋白的，一种是内参的3、洗完NC膜后，将膜剪开，分别放入目的 蛋白和内参的二抗稀释液，于慢摇的摇床孵育 1 小时。十、显色曝光（采用辣根过氧化物酶HRP_EC 光法）（一）器材和试剂准备：Western Blotti ng Lumi nol Reage nt 测试剂盒（SANTA CRUZ BITECHNOLOGY int.,sc-2048）、片盒、柯达x-omat Bt医用x

11、射线胶片（型号:xbt-1 规格（cm）:12.7x17.8cm ）、KodakX-OMAT 2000 P ROCESSQ洗片机）（二）步骤1、取出NC膜用TBST洗涤3次，每次10分钟（调 节摇床至快摇）2、用TBS润洗NC膜，放入有保鲜膜的片盒中3、将A B发光液1： 1比例混合，加入NC膜， 盖上保鲜膜和片盒的盖子4、到暗室，打开片盒擦去保鲜膜周边的发光液， 放入胶片盖上片盒盖子，分别压 10秒、30秒、 1分钟，胶片放入洗片机5、取出胶片后对着NC膜标上marker的位置丽春红染液丽春红 5g冰醋酸 1mLdH2O定容至100mL电泳液：10X1010X储备液1X 工储备Om(pH 8.3):Tris30.3g作液：、 液L90Om甘氨酸144gH2OLSDSH2O定 容至1Liog电转液：10