开心散对肾缺血再灌注大鼠肾脏保护作用研究

1、    开心散对肾缺血再灌注大鼠肾脏保护作用研究        摘要：目的：研究中药开心散对肾缺血再灌注损伤的保护作用。方法：复制大鼠肾缺血再灌注损伤模型，用开心散治疗，观察肾组织病理变化，并对肾组织LDH用显微镜-计算机真彩色像分析系统分析；测定血清和肾组织SOD、MDA、NO含量。结果：肾缺血1h灌注15min后，肾组织出现明显病理改变，肾小管LDH活性增加；血清和肾组织SOD、NO活性下降，MDA含量升高。应用开心散治疗后血清和肾组织SOD、NO活性升高，MDA含量下降

2、，肾组织病理变化有所改善。结论：开心散具有减轻脂质过氧化反应、清除自由基、保护血管内皮细胞等作用，这可能是开心散减轻肾缺血再灌注损伤作用机制之一。关键词：肾缺血再灌注损伤；缺血性肾损伤；自由基；开心散中分类号：R285.1文献标识码：A文章编号：1000-2219(2000)06-0054-02 开心散是常用益智类古方，最早记载于唐代孙思貌的千金方中，后世的益智类方药大多是在此基础上加减而来，经古人长期临床实践，证实有良好的益智、延年、延缓衰老作用。近年我们的研究表明开心散对东茛菪碱记忆障碍模型、老年大鼠、拟痴呆小鼠等动物模型具有减轻脂质过氧化反应、清除自由基的作用1。本实验复制大鼠缺血再灌注

3、损伤模型，应用中药开心散进行治疗，以探讨开心散对肾缺血再灌注损伤的保护作用和机制。1材料1.1动物雄性健康SD大鼠，由本校动物实验中心提供。随机分为对照组、缺血组、缺血再灌注组(简称再灌注组)、开心散用药组(简称用药组)。1.2药品开心散由人参、远志、石菖蒲各10g，茯苓20g组成，经水提、醇提、浓缩、低温减压干燥等，最后制成粉剂，每g药粉约含生药9.38g，动物用药剂量为0.39g/kg。1.3主要仪器显微镜-计算机真彩色像分析系统(CMIAS)由北京航天航空大学研制。半自动生化分析仪。2方法-2/N-3浓度，以反映NO水平。2.4统计学处理实验数据用±s表示，组间比较t检验。3结

4、果3.1开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠SOD活性的影响对照组血清及肾组织中SOD含量最高，与其它各组均有非常显著差异，表明动物经过缺血和缺血再灌注后SOD均下降，但以再灌注组下降最明显。用药组血清及肾组织中SOD含量升高，血清SOD含量与再灌注组比较差异有显著性，提示开心散能使模型动物SOD活性升高，见表1。表1开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠SOD活性的影响(±s)组别n血清(nu/ml)肾组织(nu/mg)对照688.71±7.8247.69±2.81缺血676.40±5.48*35.12±3.23*再灌注670.01±8.52*33.

5、27±4.12*用药685.24±11.42*#36.91±5.75*与对照组比较，*P<0.05，*P<0.01；与再灌注组比较，#P<0.05，#P<0.01；与缺血组比较，P<0.05，P<0.01(下同)3.2开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠MDA含量的影响对照组MDA含量最低，尤其是肾组织中最明显，与其它3组比较，差异有非常显著性。表明动物经过缺血和缺血再灌注后MDA均有上升，但以再灌注组MDA含量上升最明显。应用开心散后，MDA含量有所下降，在肾组织中与再灌注组比较差异有显著性(P<0.01)，结果显示开心散能降低

6、肾缺血再灌注动物MDA含量，见表2。表2开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠MDA含量的影响(±s)组别n血清(nmol/ml)肾组织(nmol/mg)对照77.69±0.817.27±0.51缺血68.15±1.1312.04±1.41*再灌注610.36±1.65*19.31±3.21*用药69.26±1.22*14.0±2.68*#3.3开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠NO活性的影响用药组血清NO含量最高，与其它3组比较差异有非常显著性。肾组织NO含量也是用药组最高，与缺血组及再灌组比较差异有显著性，但与对照组

7、比较差异无显著性，提示开心散能明显提高缺血再灌注动物血清和肾组织的NO含量。再灌注组NO含量最低，特别血清中NO与其它各组比较差异有非常显著性，见表3。表3开心散对肾缺血再灌注损伤大鼠NO活性的影响(±s)组别血清(mol/L)肾组织(mol/g)对照94.06±14.124.82±1.37缺血94.29±11.503.44±0.42*再灌注29.68±5.92*2.98±0.53*用药143.38±24.41*#6.66±2.77#2.4病理学检查HE及PAS染色：对照组肾小球、肾小管结构完整，肾间质未

8、见明显异常。再灌注组肾脏病理变化明显，主要为部分肾小管上皮细胞肿胀，出现颗粒变性和水样变性；少数上皮细胞核固缩深染，可见上皮细胞脱落至管腔内，少量肾小管腔内有蛋白性液体积聚。突出表现为肾间质血管高度扩张充血，尤其以皮髓交界处最为明显，并可见灶性出血区；部分髓质区血管也高度扩张充血。用药组及缺血组肾脏病变与再灌注组比较有所减轻。各组肾小球病变不明显。LDH染色：LDH酶反应主要定位于肾小管上皮细胞浆内，为密集、深蓝色细小颗粒。缺血组及再灌注组酶反应颜色比对照组深。肾组织化学LDH计算机像分析结果显示：对照组平均光密度和积分光密度均较低，与再灌注比较差异有显著性，此外积分光密度与缺血组比较差异也有

9、显著性，但对照组两种光密度与用药组相比较差异无显著性。用药组两种光密度均较缺血组和缺血再灌注组低，尤其是两种光密度与再灌注组比较差异均有显著性。缺血再灌注后肾小管平均密度降低，与另3组比较差异有显著性，见表4。表4各组肾组织LDH计算机像分析结果(±s)组别平均光密度积分光密度平均密度对照0.26±0.0381.91±66.02136.64±7.78缺血0.28±0.01398.94±192.41*129.84±4.46再灌注0.36±0.05*806.74±506.06*113.48±13.2

10、6*用药0.24±0.03#221.97±124.98#138.12±8.57#4讨论肾脏是一个高灌注的器官，对缺血和缺血再灌注损伤非常敏感。再灌注损伤中氧自由基起重要作用，介导整个损伤过程。氧自由基对细胞的主要损害是造成脂质过氧化，其分解产物之一便是丙二醛(malondialdihyde MAD)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)可以通过歧化作用清除体内的自由基。自由基可使细胞膜的流动性、液体性、通透性均发生改变，造成膜功能障碍，并进而影响到镶嵌在生物膜内的各种酶类的活性。生物膜结构严重破坏则影响到细胞的机能，组织细胞受损坏死，

11、血管通透性增加，血浆外渗，红细胞淤积，白细胞粘贴于血管壁，嵌顿、堵塞毛细血管等，造成缺血再灌注损伤，在肾脏表现为肾小球滤过率降低，肾小管重吸收与分泌功能障碍等2。一氧化氮(nitric oxide NO)在缺血再灌注损伤中也起一定作用3，4。本实验动物在缺血1h后，就见血清、肾组织内SOD下降、MDA升高；动物缺血1h再灌注15min后，SOD进一步下降，MDA明显升高，NO亦有所下降，与缺血组及对照组比较差别有显著性，并出现明显的病理改变，表明形成了缺血再灌注损伤。肾组织LDH染色切片经计算机像分析表明缺血和缺血再灌注后，肾小管内LDH活性增加，这可能是由于缺血缺氧，组织无氧酵解增加，激活了

12、细胞内的LDH。文献报道：自由基对酶的作用比较复杂，除可引起交联、聚合外，还可作用于酶分子的活性中心，或修饰其氨基酸，或与其中金属离子反应，从而影响酶活性。如羟自由基(OH-)可使多种酶失活，也可使多种酶激活，通过酶的激活又可引起相应的变化5。我们在大量古代方剂中选出具有“聪明益智”、“强记助神”功效的方剂42首，通过对这些方剂的源流回顾，组成、配伍、剂型等分析，发现此42首方共有药物68种，使用频率最高、排列在前四位的即为远志、石菖蒲、人参和茯苓，由此四药配伍组成的方剂即千金方方中的“开心散”。生物学衰老的重要原因之一是自由基诱发细胞膜或细胞中不饱和脂肪酸发生过氧化作用。我们以前的研究表明开

13、心散具有益智延缓衰老功能的作用机制，就在于其能减轻脂质过氧化反应、清除自由基1。肾缺血再灌注损伤的机制之一也是由于大量的自由基产生而造成的，因此开心散对之应有一定的治疗作用。本次实验结果显示，肾缺血再灌注动物应用开心散后，血清和肾组织中SOD活性升高，MDA含量降低，尤其是用药后用血清和肾组织中NO含量明显升高，肾脏病理变化改善。提示开心散对肾缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其作用机制可能是药物能减轻肾组织细胞缺血缺氧，降低肾缺血再灌注所致的过氧化脂质的增高，提高清除氧自由基的超氧化物歧化酶的活性。文献报道：心肌缺血再灌注开始数分钟后即出现冠状血管内皮损伤，NO释放水平下降，继之出现血小板、中

14、性白细胞的积聚，减少了与再灌注损伤有关的有害产物(如氧自由基)的产生。NO本身亦有对抗氧自由基的作用2。本研究发现肾缺血再灌注动物血清和肾组织中NO含量下降与文献报道一致。应用开心散后NO明显升高，推测药物对血管内皮细胞有一定的保护作用。PROTECTIVE EFFECT OF KAIXIN POWDER ON KIDNEYIN RATS WITH ISCHEMIA-REPERFUSION INJURYHUANG Yu-fang,DAI Xiao-ming,WU Hui-ping,BIAN Hui-ming,JIANG Feng-yong(Nanjing University of Tradi

15、tional Chinese Medicine,Jiangsu Nanjing210029,China)Abstract：Objective：To study the protective actionof Kaixin powder on the kidney in the cases of ischemia-reperfusion injury.Method:The models of ischemia-reperfusion injury were constructed in rats.The pathological changes of the tissues in the kid

16、ney were observed and shades of lactic acid dehydrogenase (LDH)in the kidney tissue were analyzed with computer.The content of superoxide dismutase(SOD),malondialdihyde(MDA) and nitric oxide(NO) in the serum and kidney tissues were measured.Result:After ischemia of the kidney tissues was kept for 1

17、hour and reperfusion 15 minutes,significant pathological changes in the kidney tissues was kept for 1 hour and LDH in the renal tubulars were increased.The activity of SOD and NO in the serum and kidney tissue were decreased and the content of MDA were increased.After Kaixin powder wasadministered,t

18、he activity of SOD and NO were increased,the content of MDA were lowered and the pathological changes of the kidney tissues were improved.Conclusion:Kaixin powder can alleviate lipid peroxidation,get rid of free radicals and protect the endothelial cell of blood vessels.This may be one of the mechanisms that improve ischemia-reperfusion injury of the kidney.Key words：Kidney ischemia-reperfusion injury;Ischemic kidney injury Free radical； Kaixin powder基金项目：南京中医药大学自然