雷公藤红素阻断全反式维甲酸导致的白血病细胞与内皮细胞黏附

1、雷公藤红素阻断全反式维甲酸导致的白血病细胞与内皮细胞黏附             作者：徐莉敏， 张登海， 杨春欣， 刘旭辉 【摘要】  全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病，引起白血病细胞与内皮细胞之间黏附增加，是发生维甲酸综合征的重要原因。本文观察雷公藤红素对这种黏附增加的影响。方法:用流式细胞术检测雷公藤红素对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular

2、 endothelial cell， HUVEC）在ATRA刺激下表达黏附分子的影响。用细胞黏附功能实验，检测雷公藤红素对ATRA导致的上述两种细胞之间黏附增加的影响。结果:ATRA能引起NB4细胞表面细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）表达增加，但可被雷公藤红素明显抑制（ P 0.01）。NB4细胞上清液能刺激HUVEC表达ICAM-1（ P 0.05）;而被ATRA处理过的NB4细胞上清液能明显刺激HUVEC表达选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molec

3、ule-1， VCAM-1）和ICAM-1等黏附分子（ P 0.01），雷公藤红素对其抑制率分别达25.3%、42.4%和61.0%。ATRA导致上述两种细胞之间黏附增加，雷公藤红素对其完全抑制。结论:雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞黏附，有可能用于维甲酸综合征的治疗。 【关键词】  雷公藤红素维甲酸综合征是全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）过程中出现的一种具炎症性特征和能导致死亡的严重并发症。其发生机制虽不完全清楚，但一般认为，与A

4、TRA导致白血病细胞与内皮细胞的黏附能力增加，进而使大量细胞浸润组织和器官有关13。最近，我们发现，雷公藤红素能抑制炎症因子活化的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell， HUVEC）表达黏附分子，并抑制内皮细胞与白细胞的黏附4，提示其有可能用于维甲酸综合征的治疗。本研究以急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和HUVEC为细胞模型，观察雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与HUVEC黏附增加的影响。1 材料与方法1 试剂 ATRA，Sigma公司产品，用无水乙醇溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 冰箱中保存。工作浓度为1 mo

5、l/L，用培养液临时配制。雷公藤红素，上海中山医院药剂科提取及纯化，方法见文献5，DMSO溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 冰箱中保存，工作浓度为200 nmol/L，用培养液临时配制。荧光直标鼠抗人VCAM-1-PE和E-selectin-PE，美国BD公司产品;鼠抗人ICAM-1-FITC，法国Diaclone公司产品。2 NB4细胞培养 NB4细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供（源自美国ATCC）。RPMI 1640（Invitrogen， 法国），10%小牛血清（Cambrex， 法国），1%青霉素-链霉素，37 ，5% CO2培养。取对数生长期的细胞进行实

6、验。3 HUVEC培养 HUVEC细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供。分离及培养方法见文献4。EBM2培养液（Invitrogen， 法国），加5%小牛血清，1%青霉素-链霉素，0.4%重组人纤维母细胞生长因子-B（recombinant human fibroblast growth factor-B， rhFGF-B）、0.1%重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth factor， rhVEGF）、0.1%长效胰岛素样生长因子（long R insulin-like growth factor， R3

7、-IGF-1） 和0.1 %重组人上皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor， rhEGF），均为法国Cam-brex公司产品，37 ，5% CO2培养。取35代的HUVEC进行实验。1.4 NB4细胞上清液的制备 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml加入培养体系进行传代培养。设对照、雷公藤红素、ATRA、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。37 ，5% CO2培养24 h。300 g 离心5 min，弃细胞，再1 200 g 离心 10 min ，收集上清，-20 冻存。5 ATRA和雷公藤红素对NB4细胞黏附分

8、子表达的影响 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml进行培养。设对照、雷公藤红素、 ATRA 、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。 37 ，5% CO 2培养24 h2。选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion mole-cule-1， VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（intercellu-lar adhesion molecule-1， ICAM-1）的表达情况用流式细胞术检测4。6 NB4细胞上清液对HUVEC表达黏附分子的影响 取贴壁生长良好的HUVEC，按5×10 4/ml，接种于24孔

9、培养板中，每孔1 ml。待细胞长满时，分别加入NB4细胞上清液（与培养液等体积），设对照组，均设复孔。E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的检测同1.5。1.7 抗体标记 取1×10 5个细胞，PBS清洗两遍后，分别与荧光直标鼠抗人E-selectin-PE、VCAM-1-PE和ICAM-1-FITC，于4 反应30 min，总体积20 l。然后转移至含PBS的流式细胞仪测定管，总体积250 l。8 流式细胞术检测 FACS Calibur（美国BD公司）的发射激光由氩离子激光器产生，功率为 15 mW ，激发光波长为488 nm。FITC和PE荧光分别设在FL-1和FL

10、-2荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集10 000个细胞，采用Cell Quest软件进行结果分析。9 细胞黏附功能实验 NB4细胞和HUVEC分别接受ATRA、雷公藤红素和NB4细胞上清液处理24 h后，按试剂盒（法国Molecular Probes公司）操作说明书进行。取5×105未处理或处理的NB4细胞，用PBS洗两遍后，悬浮于1 ml不含血清的 RPMI 1640培养液中。加5 l荧光染料calcein AM于悬浮细胞，使calcein AM最后浓度为 5 mol/L ，充分混匀后，置37 孵育30 min。然后用预温的RPMI 1640洗两遍，重新悬浮并

11、调整细胞浓度为 5× 10 5/ml。取标记好的细胞100 l放于长满 HUVEC （未处理或处理）的96孔板内，于37 孵育30 min，取出后，在摇床上轻轻震荡3 min，吸弃上清，然后用不含酚红的RPMI洗4遍后，每孔加200 l PBS。用荧光读板机（BioTek，德国）读取结果（吸收光谱494 nm，发射光谱517 nm）。1.10 统计学方法 每组实验重复3次，用组间 t 检验对结果进行统计分析。2 结果2.1 ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用 NB4细胞表面与细胞黏附相关的E-selectin和VCAM-1表达很低，ICAM-1有少量的表达。NB

12、4细胞被ATRA诱导24 h后，其表面E-selectin 和VCAM-1的表达无明显变化（ P 0.05），但ICAM-1的表达明显增加（ P 0.01 ）。雷公藤红素不改变ATRA诱导后的NB4细胞表达E-selectin 和VCAM-1（ P 0.05），但能明显降低其ICAM-1的表达水平（ P 0.01）。见表1。2.2 雷公藤红素对NB4细胞上清液刺激HUVEC 表达黏附分子的影响 HUVEC未接受刺激时， E-selectin、 VCAM-1和ICAM-1呈现为低水平表达。NB4细胞上清液刺激HUVEC 24 h后，不能增加HUVEC表面E-selectin和VCAM-1的表达

13、（ P 0.05），但能使其ICAM-1的表达水平增加 （ P 0.05 ）。ATRA诱导24 h后的NB4细胞上清液，能使HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的表达均明显增加（ P 0.01）。对被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1，雷公藤红素可明显抑制，其抑制率分别达到25.3%、42.4%和 61.0%。 见表2。2.3 雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与 HUVEC 黏附能力改变的影响 与对照组相比，ATRA诱导24 h的NB4细胞，与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率约增加了（1

14、4.7±3.4）%。雷公藤红素+ATRA共处理的NB4细胞，其与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率下降至对照组的（96.1±0.2）%         ;被NB4细胞上清液刺激24 h的HUVEC，与ATRA诱导24 h的NB4细胞进行黏附，结果显示，与NB4细胞上清液组相比，ATRA诱导的NB4细胞上清液使 HUVEC 与ATRA诱导24 h的NB4细胞之间的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而与NB4细胞上清液组相比，雷公藤红素能使其黏附率下降至（95.1±

15、; 18.4 ）%。见图1、2。表1 ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用（略）Table 1 ATRA-induced expressions of adhesive molecules in NB4 cells and the blocking effects of tripterine*P 0.01， vs control group;P 0.01， vs ATRA group.表2 雷公藤红素对NB4培养上清刺激HUVEC表达黏附分子的影响（略）Table 2 Effect of tripterine on expressions of adhesive molec

16、ules in HUVEC stimulated by conditioned medium of NB4*P 0.05，*P 0.01， vs control group. CM: conditioned medium.图1 NB4细胞不同处理后与HUVEC黏附（略）Figure 1 NB4 cell adhesion to unstimulatedHUVECNB4 cells were cultured with 1 mol/L ATRA， 200 nmol/L tripterine or the vehicle for 24 h before the adhesion assay. Th

17、e results are ex-pressed as percentage of relative adhesion compared with the control and are mean±SD of three experiments.图2 HUVEC不同处理后与NB4细胞（ATRA诱导）黏附（略）Figure 2 HUVEC adhesion to ATRA-treated NB4 cellsHUVEC were cultured with NB4 cell conditioned medium （NB4-CM）， ATRA-NB4-CM， ATRA+tripterine

18、-NB4-CM or tripterine-NB4-CM for 24 h before the adhesion assay. The results are expressed as percentage of relative adhesion compared with the con-trol and are mean±SD of three experiments.3 讨论多个研究表明，APL细胞的黏附能力增加、以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附增加，是ATRA治疗引起维甲酸综合征发生的主要机制之一13， 6。因此，阻断黏附增加，被认为是治疗维甲酸综合征的策略之一。本研究

19、首次发现，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子;抑制ATRA处理的NB4细胞上清液刺激HUVEC表达黏附分子;而且ATRA导致的NB4细胞与HUVEC 黏附增加，能被雷公藤红素完全抑制。雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的三萜类单体，有很强抗炎能力710。 我们最近的研究结果显示4，对内皮细胞培养无毒性剂量（20200 nmol/L）的雷公藤红素 ，能够通过阻断肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-， TNF-）和白细胞介素-1（inter-leukin-1， IL-1）等炎症因子导致的核转录因子-B（nuclear transcription facto

20、r-B， NF-B）向细胞核内转移，从而抑制被这些因子活化的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子。受此启发，本研究观察雷公藤红素对ATRA导致的APL细胞与内皮细胞黏附增加的影响，并且也采用 200 nmol/L 的雷公藤红素作为本实验剂量。本研究首先观察了雷公藤红素对ATRA导致的NB4细胞表面黏附分子表达增加的影响。发现ATRA导致NB4细胞表面黏附分子ICAM-1的表达明显增加（ P 0.01），与文献报道2，11相符，而雷公藤红素明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表面ICAM-1的表达（ P 0.01）。而ICAM-1在ATRA引起的APL细胞之间的黏

21、附聚集，以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附中起重要作用2，11。事实上，APL细胞与内皮细胞之间黏附增加取决于两个方面:一是APL细胞表达黏附分子增加;二是内皮细胞表达黏附分子也增加。有报道， ATRA 导致APL细胞分泌IL-1能力增加12，13，而IL-1能活化内皮细胞，使其表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1被诱导性表达增加，增强内皮细胞的滚动黏附、紧密黏附的能力14。在我们的研究中，ATRA本身无明显刺激HUVEC表达黏附分子作用，NB4细胞培养上清液也仅能增加ICAM-1的表达，但经ATRA诱导的NB4细胞培养上清液能明显刺激HUVEC表达E-selectin、VC

22、AM-1和ICAM-1等黏附分子（ P 0.01），而雷公藤红素对其抑制率分别达到25.3%、42.4%和61.0%。这可能是雷公藤红素阻断了ATRA诱导的NB4细胞上清液中的炎症因子对HUVEC的活化能力。正如前述，细胞间黏附的本质是黏附分子的表达，雷公藤红素能抑制ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子，抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子，提示雷公藤红素也可能会抑制两者之间的相互黏附，为此，我们进行了两种模式的细胞黏附功能试验。实验结果证实，ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（未被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）黏附率增加了（14.7± 3.4）%

23、，雷公藤红素对其能完全抑制;ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而雷公藤红素对其亦能完全抑制。其抑制效果好于用单克隆抗体各自封闭HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-12。综上所述，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子、抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子、完全抑制ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加等研究表明，雷公藤红素在阻断ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加方面有显着效果，提示雷公藤红素作为中药单体，有望成为治疗

24、维甲酸综合征的新药物，但实际效果有待动物实验和临床进一步证实。【参考文献】  1Larson RS， Tallman MS. Retinoic acid syndrome: mani-festations， pathogenesis， and treatment. Best Prac Res Clin Haematol. 2003; 16（3）: 453-461. 2 Marchetti M， Falanga A， Giovanelli S， et al. All-trans-retinoic acid increases adhesion to endothelium of the

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26、 et al. Tripterine inhibits the expression of adhesion molecules in activated endo-thelial cells. J Leukoc Biol. 2006; 80（2）: 309-319. 5 Morota T， Ogino T， Katsuhara T， et al. D: A-friedo-24-noroleanane triterpenoids fromTripterigium wilfordii. Phytochemistry. 1      &#

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