急性髓细胞白血病FLT3ITD基因突变的检测及其临床意义

1、急性髓细胞白血病FLT3ITD基因突变的检测及其临床意义         11-01-07 13:22:00     编辑：studa20                  作者：尹列芬，王晔，姚锦，黄桂云，瞿晓媛，杨玲【摘要】  目的 探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukem

2、ia, AML)患者人Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication, FLT3ITD)基因突变及其临床意义。方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography, PCRDHPLC)方法检测60例初治AML患者和10例对照组骨髓FLT3ITD基因突变。结果 60例AML患者FLT3ITD突变阳性率21.67%(13/60)，10例对照组均未检测到该突变;FAB各亚型FLT

3、3ITD突变率不同，有M3型突变率较高的趋势;FLT3ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性组(P<0.01);FLT3ITD阳性组完全缓解(CR)率低于FLT3ITD阴性组(P<0.05)。结论 FLT3ITD基因突变多见于M3患者，FLT3ITD阳性者具有外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高、CR率低的特点。FLT3ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。 【关键词】  急性髓细胞白血病;FLT3;内部串联重复;基因;聚合酶链反应变性高效液相色谱技术ABSTRACT: Objective To investigate the mut

4、ation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh perform

5、ance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation, which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate, and M3 had an obviously higher mutation rate than other subt

6、ypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P<0.01). The complete remission rate was significantly lower in patients with FLT3ITD mutation than those without (P<0.05). Conclusion FLT3ITD mu

7、tation is likely to occur in M3 of AML patients. FLT3ITD mutation is associated with a higher peripheral white cell count and a higher percentage of bone marrow blast cells and a lower complete remission rate compared with those patients without FLT3ITD mutation. The detection of FLT3ITD mutation ma

8、y be used as an index of AML prognosis.KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography人FLT3是型酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族成员的原癌基因，其蛋白产物属于受体，定位于细胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的表达仅限于CD34+干/祖细胞，该受体与多种胞浆

9、蛋白作用介导一系列细胞内信号传导，诱导细胞增殖和分化。近来研究发现FLT3基因的异常表达、突变与急性白血病(acute leukemia, AL)的发生、发展、预后有密切关系13。酪氨酸激酶受体基因FLT3的内部串联重复序列(FLT3 internal tandem duplications, FLT3ITD)是一种FLT3的近膜区的突变，由NAKAO等4研究急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)时，于1996年首先报道。为探讨AML患者FLT3ITD的突变情况，我们采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondena

10、turing high performance liquid chromatography, PCRDHPLC)技术检测60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突变情况并分析其临床意义。1 材料与方法1.1 研究对象 60例初治AML患者，诊断及疗效标准参照血液病诊断及疗效标准5。男27例，女33例，中位年龄48岁(1879岁)。FAB分型为M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年龄>60岁)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者为对照组共10例(3例健康人，5例缺铁性贫血患者，2例特发性血小板

11、减少性紫癜患者)。1.2 实验方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(PCRDHPLC)方法。DNA制备。取患者骨髓液2mL，应用美国Promega公司DNA提取试剂盒抽提总DNA。测定吸光度A260nm/A280nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本为1g/L。PCR扩增。应用Primer Express V2.0软件包以13号染色体外显子14、15设计引物，包括整个近膜区(JM)和激酶结构起始部分，扩增产物为329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正义引物：5GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3;反义引物：5CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3。PC

12、R反应体系(50L)：10×PCR缓冲液5L，25mmol/L MgCl2 6L，10mmol/L dNTP 1L，10mol/L正/反义引物各2L，模板DNA 4L，Taq DNA酶0.5L，双蒸水29.5L。PCR条件：94，5min，1个循环;94，45s，56，45s，72，45s，共循环35次;72延伸10min，1个循环。测序分析。部分变性DHPLC分析突变阳性产物：5L预处理的PCR产物上样于Transgenomic公司的DNA sep分离柱，然后观察DHPLC图谱形态。发现异常的图谱形态PCR产物，纯化后测序(由大连宝生物生物公司帮助完成)，分析各FLT3ITD序列。

13、1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析。计量资料在作t检验、方差分析前先进行正态性、方差齐性检验，单变量两组资料采用t检验，方差不齐者采用非参数检验;计数资料采用卡方检验，P<0.05为差别有统计学意义。2 结 果2.1 AML患者FLT3/ITD基因突变的检测 60例初发AML患者，13例FLT3ITD突变阳性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未检测到该突变，有M3型突变率较高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。本实验检测的突变均为杂和突变，各例突变区域大小不等(6100bp)，均为框内突变。10例对照组均未检测到突变。2.2 FLT3ITD阳性AML患者临床特征 60例初治AML组中，13例FLT3ITD突变阳性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差异无统计学意义(