急性髓系白血病细胞Flt-3表达及Flt-3ITD突变分析

1、急性髓系白血病细胞Flt-3表达及Flt-3/ITD突变分析         08-03-04 09:35:00     编辑：studa20                 作者：汪亚伦，王彤，许凤，冮岩，王杰【摘要】  本研究探讨急性白血病（acute leukemia，AL）细胞株Flt-3基因表达和F

2、lt-3/ITD突变与急性白血病特别是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)发病的关系。采用RT-PCR分析联合测序的方法检测82例白血病细胞株，其中包括20例AML细胞株和57例急性淋巴细胞白血病细胞株（ALL），5株CML细胞株的Flt-3表达和Flt-3/ITD突变。结果表明： 77例AL细胞株中有48例Flt-3表达阳性，阳性表达率为62%，其中20例AML细胞株中有12例阳性，阳性表达率为60%；57例ALL细胞株中有33例阳性，阳性表达率为58%。5例CML细胞株中有3例阳性，阳性表达率为60%。12例Flt-3表达阳性的AML中有1例AMOL细胞株

3、存在有异常表达（阳性率为8.3%），测序显示存在有29 bp的两个编码重复序列，其余Flt-3表达阳性的细胞株未检出重复序列。未分化B细胞系Flt-3基因表达阳性率明显高于成熟B细胞ALL (P<0.05)。结论: Flt-3基因在不同种类的白血病细胞中存在着不同程度的表达，在其中1例AML中发现有Flt-3/ITD重复序列。Flt-3基因及Flt-3/ITD突变检测可能有助于ALL特别是AML的诊断。 【关键词】  Flt-3 基因Analysis of Flt-3 Expression and Flt-3/ITD Mutation in Acute Myeloid Leuk

4、emia CellsAbstract This study was aimed to  explore the relationship between Flt-3 expression，Flt-3/ITD mutation in acute leukemia (AL) cell line and pathogenesis of  AL，especially AML. The Flt-3 expression and  Flt-3/ITD mutation were detected by RT-PCR and sequencing method in 82 le

5、ukemia cell lines  including 20 AML，57  ALL and 5 CML cell lines. The results  indicated that  positive results of Flt-3 expression were obtained in 48  out of 77  AL cell line，the positive rate was 62%;  12 cell lines were positive in 20  AML cell lines，the p

6、ositive rate was 60%; 33 cell lines was   positive in 57 ALL cell lines，the positive rate was 58%; 3 cell lines were  positive in 5 CML cell lines，the positive rate was 60%. There was abnormal gene product in 1 AMOL cell line out of 12 AML cell lines with  Flt-3 positive expressi

7、on (positive rate 8.3%). DNA sequencing of abnormal gene product showed  two coding duplication sequence with 29 bp long. The positive rate of   Flt-3 expression in undifferentiated cell line was prominently higher than that in  mature B cell ALL (P<0.05). It is concluded 

8、; that the Flt-3 expression is  different in various  leukemia cells. Flt-3/ITD duplication was found in one AML cell line. The detection of Flt-3 gene and Flt-3/ITD mutation may contribute to the  diagnosis of ALL，especially to AML.Key words    AML； Flt-3 gene； Flt-3/I

9、TD mutation    近年来的研究表明，Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，Flt-3)在正常的造血分化过程中具有重要的作用1。人Flt-3基因定位于染色体13q12，具有RTKm成员共同的结构，由胞外5个免疫球蛋白样结构区、近膜区(JM)、穿膜的2个激酶区(TK1和TK2)由1个激酶插入区(KI)分隔、C-端胞内区等几部分构成2。Flt-3除了在胸腺、肝、脾和淋巴结等组织中表达之外，而且也存在于人骨髓等造血系统，具有诱导造血干细胞分化和增殖的作用。Flt-3跨膜区内部串联重复(internal tandem dup

10、lication，ITD)突变是近年来发现的Flt-3 基因最常见的一种突变类型，与AML的发生有关，是AML中发生率最高且与预后相关的突变3。为探讨Flt-3特别是Flt-3/ITD突变在恶性血液病不同类型、亚型的突变及分布情况，我们运用聚合酶链反应结合测序的方法对不同种类的AL细胞株的Flt-3基因表达和Flt-3/ITD突变进行了研究，探讨Flt-3与AML发生的关系。材料和方法白血病细胞株82个白血病细胞株包括AML细胞株20个(AML M1/M2 11个，AMMOL M4 1个，AMOL M5 8个)，ALL细胞株57个(c-ALL 21个，pre-B ALL 9个，B-ALL 11

11、个，T-ALL 16个) 和CML细胞株5个。细胞的采集取用ACD-A抗凝骨髓5 ml，常规分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，其中2名健康献髓者BMMNC用CD34+ 免疫磁珠(Stem cell公司)进一步分选收集CD34+细胞待用。采集静脉血，ACD-A抗凝，400×g离心10 分钟，分取血浆，置于-20冻存供检测用。RT-PCR总RNA的提取 用TRIzoL试剂盒(Gibco BRL)，按其说明书提取细胞总RNA。cDNA的合成 取2 g 总RNA，用随机引物(Gibco/BRL)及SuperScrip试剂盒(Gibco BRL)，按说明书逆转录成cDNA后

12、-20冻存待用。PCR反应针对Flt-3基因ITD突变主要发生在11号外显子和12号外显子之间，在11号外显子近端和12号外显子远端分别设计序列引物。阴性对照组为-actin。引物序列如下：R5-Flt-3：5-TGTCGAGCAGTAC TCTAAACA-3;R6-Flt-3：5-ATCCTAGTACCTT CCCAAACT-3; -actin-sense：5-CTTCTACAAT GAGCTGCGTG-3; -actin-antisense：5-TCATGAG GTAGTCAGTCAGG-3。    PCR反应系统为50 l 体系(cDNA 2 l，引物浓度4

13、00 nmol/L，Taq酶1 U)，反应条件为：94 10分钟，94 变性1分钟，72 延伸1分钟，59 退火1分钟，共35个循环，最后72 延伸1.5分钟。取10 l PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，紫外线照相。PCR产物鉴定及序列分析用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)回收纯化PCR产物，按ABI PRISM Big-Dye terminator cycle squencing ready reaction试剂盒(PE)说明书进行序列分析，所得序列资料在GenBank用BLAST Research软件进行同源序列搜索，确定PCR扩增产物进行分析。结 果

14、各细胞系Flt-3的表达野生型Flt-3 扩增产物为366 bp，发生Flt-3/ ITD 突变扩增出高分子量片段，约400 bp。通过Flt-3基因外显子11和12的PCR产物扩增和3%的琼脂糖凝胶电泳显示：所检测的57个ALL细胞株发现33个Flt-3基因阳性，阳性率为58%。各免疫亚型ALL细胞株检测阳性率为：c-ALL 76%(16/21)，pre-B ALL 67 %(6/9)，B-ALL 36 %(4/11)，T-ALL 44 %(7/16)。20个AML细胞株发现12个Flt-3基因检测阳性，阳性率60 %。各免疫亚型AML细胞株检测阳性率为：AML 56%(5/9)，AMOL

15、63%(5/8)。AMOL中1个PCR 扩增后在366 bp上方出现1条特异性条带。5个CML细胞株中3个（60%）Flt-3基因检测阳性（图1）。B细胞系ALL细胞株分化度与Flt-3表达按B细胞系ALL细胞株分化度统计，未分化B细胞30例中Flt-3阳性为22例，阴性为8例，阳性率为73%。各免疫亚型检测率分别为：c-ALL 94%(15/16)，pre-B ALL 67 % (6/9)。成熟B细胞ALL 27例中Flt-3阳性为11例，阴性为16例，阳性率为41%。各免疫亚型检测率分别为：B-ALL 36%（4/11），T-ALL 43.7%（7/16）。统计学分析显示，未分化B细胞系Flt-3突变基因检测阳性率显著高于成熟，B细胞ALL ( P<0.05)，说明B细胞系ALL中细胞分化越成熟则Flt-3突变基因检测阳性率越低（表1）。Table 1. Expression rate of Flt-3 in sever