急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-α水平变化的研究(1)

1、急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-水平变化的研究(1)                 作者：王书红，达万明，靳海杰，靖域，颜光涛【摘要】  为了探讨细胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8在异基因造血干细胞移植后aGVHD发病中的作用，观察33例Allo-HSCT患者aGVHD的发病情况。aGVHD的诊断主要依据临床表现，部分病例还依据皮肤、肠粘膜活检的病理学变化。移植前后定

2、期采集患者血清，采用放射免疫法检测细胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8的浓度的变化。结果发现，异基因造血干细胞移植后33例患者均获得造血功能重建，13例发生aGVHD，其中8例度aGVHD，5例-度aGVHD。IL-2、TNF-水平在aGVHD阳性组明显高于aGVHD阴性组，而IL-10的水平在aGVHD阳性组明显低于aGVHD阴性组，IL-8水平的变化无统计学意义。结论： 细胞因子IL-2、TNF-在临床aGVHD的发病中起重要的正向调节作用，定期检测患者血清的IL-2、TNF-水平有助于预测aGVHD的发生。 【关键词】  IL-2； TNF-； IL-10； IL-

3、8； 急性移植物抗宿主病； 异基因造血干细胞移植Changes of  IL-2，IL-8，IL-10 and TNF-  levels in Sera of Patients with  Acute Graft-Versus-Host DiseaseAbstract    The purpose of this study was to explore the roles of cytokines  IL-2，TNF-，IL-10 and IL-8 in the pathogenesis of acute graft-ve

4、rsus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The incidence of aGVHD was observed in 33 patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The aGVHD was clinically diagnosed. Sera from the 33 patients were taken before and after allogeneic hematopoi

5、etic stem cell transplantation.  The IL-2，TNF-，IL-8，IL-10 levels  in serum of 33 patients were measured serially  by  using radioimmuno-assay(RIA). aGVHD occured in 13 patients  including 8 patients with aGVHD I and 5 patients with aGVHD -.  The results showed that the

6、circulating levels of IL-2  and TNF-  were markedly elevated during aGVHD and strongly correlated with the severity of aGVHD as compared with  patients without aGVHD. However，the level of the IL-10 in patients with aGVHD was significantly  lower than that in patients  withou

7、t aGVHD. The change of IL-8 level was not significant statistically.  It is concluded  that IL-2 and TNF- may play important roles in the pathogenesis of aGVHD，and  measurement of serum IL-2 and TNF- levels after allo-HSCT can provide predictive indicator for acute GVHD.Key words 

8、;  IL-2; TNF-; IL-10;  IL-8;  aGVHD; allo-HSCT异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗恶性血液病和非恶性遗传性缺陷的有效手段，移植后涉及一系列移植相关并发症，如急性、慢性移植物抗宿主病、肝静脉闭塞综合症、严重感染、间质性肺炎等。其中，急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植的主要并发症之一，发生率高达30%-60%，并造成约20%的移植相关死亡率，严重影响患者的生存时间和生存质量。因此，aGVHD的发病机理研究是当今移植免疫的重点课题。aGVHD发生的中心环节是供者来源的T细胞识别受者的异体抗原而

9、被激活，由于过量释放细胞因子引起受者多器官损伤的免疫病理过程。本研究探讨可能引发aGVHD的细胞因子的作用，以期对aGVHD更好的早期防治提供实验依据。材料和方法临床资料及研究对象以33例异基因造血干细胞移植患者作为研究对象。所有33例病例均来自我院及307医院，研究时间为2002年2月至 2005年 2月，其中男性17例，女性16例，年龄 17-48岁 (中位年龄为31岁 )。33例中慢性粒细胞白血病 8例（慢性期 6例、加速期2例），急性非淋巴细胞白血病 15例，（完全缓解12例，M5原发耐药未缓解 2例，M6复发1例），骨髓增生异常综合征 4例（RA 3例、RAEB-T 1例），急性淋巴

10、细胞白血病完全缓解3例，淋巴瘤（NHL/ALL）中枢受累1例，急性再生障碍性贫血1例，左乳低分化腺癌术后肺转移1例。供者情况同胞供者30例，非亲缘供者2例（台湾慈济骨髓库），非亲缘脐血1例（山东脐血库）。HLA配型及ABO血型33例供受者HLA配型的结果均完全相同，ABO血型相合22例，不合11例（主要不合5例，次要不合6例）。移植类型24例异基因外周血干细胞移植，供者为HLA完全相合的同胞，另9例为异基因骨髓移植。预处理方案对白血病患者采用经典Cy+TBI： 环磷酰胺60 mg/ (kg·d)，连用2天，给美司钠拮抗出血性膀胱炎，全身照射6-10 Gy，分2天进行，肺受照剂量<

11、;8 Gy；1例急性再生障碍性贫血患者采用ATG+环磷酰胺；2例无血缘关系供者骨髓移植采用马利兰+阿糖胞苷+环磷酰胺；1例左乳低分化腺癌术后肺转移的患者采用氟达拉宾+环磷酰胺。供者造血干细胞采集allo-PBSCT供者应用G-CSF 300 g/d，皮下注射，连用3天，第4天始行造血干细胞采集。干细胞均经中心静脉回输给患者。对供者为O型或者受者为AB型的次要血型不和者，回输过程中注意慢输或稀释后输。对主要血型不合者为防止移植后溶血，用羟乙基淀粉沉降并且除去移植物中的红细胞。全部患者接受全环境保护、血制品与细胞因子（G-CSF）应用及营养支持治疗。aGVHD的诊断及预防、治疗方案 aGVHD的诊

12、断及分级 参照美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心Thomas等于1975年提出的分级诊断方法。7例患者还进行皮肤活检取得病理学证据，5例出现肠道aGVHD的患者，均经结肠镜检查及肠粘膜活检取得病理学证据。预防方案  采用环孢霉素（CsA）以及短疗程氨甲喋呤（MTX）方案。MTX的用法为移植后1天15 mg/m2静脉滴注，移植后第 3、6、11天剂量为10 mg/m2 ； CsA用法为1.5-2 mg/ (kg·d)持续静脉滴注24小时，时间为移植前1天到移植后30天。对环孢霉素A应每周查浓度，最好根据血药浓度调整用药剂量，直至患者无严重胃肠症状后改为口服(

13、3  mg/kg)，依据情况维持、减量。治疗aGVHD多用甲基强的松龙40 mg，2次/日，静脉滴注，好转后改口服强的松，并逐渐减量。或者用他可莫司（FK-506），剂量为0.03  mg/kg。样品（血清标本）收集按照静脉采血的常规，定期地采集所有allo-HSCT的患者的外周血约3 ml，离心后分离血清，所有血清标本置于1.5 ml  Eppendorf管中，编号之后储存于-80冰箱内。采血时间分别为：  移植前（7天左右）；  移植后每周抽取1次外周血，连续6-12周。    细胞因子检测本次实验采

14、用放射免疫分析技术检测33例患者移植前后血清的细胞因子（ IL-2、TNF-、IL-8、IL-10）的浓度，所采用的IL-2、TNF-、IL-8、IL-10放射免疫试剂盒为人细胞因子检测试剂盒，试剂盒来自解放军总医院生物化学研究所放射免疫室（原北京东亚免疫技术研究所）。取聚苯乙烯试管编号，按放射免疫药盒加样程序操作，加入分离剂后充分混匀，室温放置20分钟，4   500×g离心25分钟，吸弃上清液，在自动计数器上测放射性。本实验采用SN-682型放射免疫计数器，自动计数，结果由SN-695型 gamma计数放射免疫自动分析程序直接给出有关技术参数、标准曲线及待测样

15、品浓度ng/ml，并由相连的计算机打印出结果。植入证据供受者性别不同，采用性染色体观察法；供受者ABO血型不同，观察血型变化；供受者性别及血型均相同，采用PCR检测DNA可变串重复序列。统计学处理本实验数据采用STATA计算机统计处理系统进行分析，所有数据采用均数±标准差（X±SD）表示，进行计量资料t检验。结果造血功能重建33例患者异基因移植后经性染色体、ABO血型、DNA可变串重复序列检查证实，均为供者型完全植入，均获得造血功能重建。中性粒细胞恢复到0.5×109/L及血小板恢复到20×109/L的中位时间分别为移植后15（10-23）天及20（10

16、-66）天。 1      （version 9.00）.Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for: ages; height; weight; anesthetic effect ratings; the period from anesthesia to operation, and Apgar scores of 1 minute after the fetus was taken out; SBP, DBP, HR, and SBP×

17、HR prior to and after anesthesia. t Test was conducted for intra-group comparison. 0.05.     1.8  Medical Ethics   It met the requirements of law and ethics to supplement with an intravenous drug in case of no or poor anesthetic effects, and was agreed by the Scien

18、tific & Technological Committee of our hospital.    2  Result    2.1  General Data  Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for general data such as ages, weight, height, the period from anesthesia to operation, and Apgar score

19、s, value of P>0.05; in all inter-group comparisons, P>0.05 （Table 1）.Table 1  General Data of Maternal 1          （version 9.00）.Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for: ages; height; weight; anesthetic effect ratings; the period from anesthesia to operation, and Apgar scores of 1 minute after the fetus was taken out; SBP, DBP, HR, and SBP×HR prior to and after anesthesia. t Test was conducted for intra-group comparison. 0.05.