眼眶横纹肌肉瘤N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的异常表达

1、眼眶横纹肌肉瘤N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的异常表达【摘要】目的研究眼眶横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS ）N-ras癌基因点突变、rasp21、p53蛋白的异常表达，探讨基因突变在眼眶RMS发病中的作用。方法应用特异性高突变区位不同的突变型寡核苷酸探针及突变型rasp21、p53单克隆抗体，对21例眼眶RMS组织进行DNA 斑点杂交和免疫组织化学分析。结果4例眼眶RMS细胞中发生N-ras癌基因12密码子第2个碱基突变，5例眼眶RMS组织中发生61密码子第3个碱基突变，其中2例同时有2个密码子碱基突变。免疫组织化学检测，rasp21及p53蛋白阳性表达

2、增强者分别为9例和16例，rasp21、p53蛋白阳性表达增强者其预后较无异常表达者差。结论眼眶RMS组织中癌基因ras和抑癌基因p53突变，在眼眶RMS发病中起重要作用。【关键词】横纹肌肉瘤；眼眶；癌基因Point mutations of N-ras oncogene and abnormal expression of rasp21, p53 proteins in orbital rhabdomyosarcomaZHANG Hong?, SONG Guoxiang, ZHANG Shumin, et al.Department of Ophthalmology, The Second

3、Teaching Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China【Abstract】ObjectiveThe point mutations of N-ras oncogene and the abnormal expression of rasp21 and p53 proteins in orbital rhabdomyosarcoma (RMS) were analyzed in order to explore the role of oncogene mutations in the pathogenesis o

4、f orbital RMS and its relation to patients prognosis. Method21 human orbital RMS tissues were analyzed by dot-blot hybridization and immunohistochemistry using synthetic specific oligonucleotide probes and mutant rasp21, p53 monoclonal antibodies. ResultsThe second base mutation of codon 12 of the N

5、-ras oncogene was found in 4 patients. The third base mutation of codon 61 was found in 5 patients. The mutant rate was 33.3%. By immunohistochemistry analysis, the overexpression of rasp21 and p53 protein level was found in 42.9% and 76.2% respectively. The prognosis of patients with overexpression

6、 of ras p21, p53 was worse than that of normal expression (P1.851014 Bq（亚辉生物医学工程公司），利用T4多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记寡核苷酸探针5-末端。(2)分子杂交：将肿瘤组织及对照组织行PCR，扩增产物加热煮沸10 min，使其充分变性，再用负压吸引器将PCR产物10 l滴于尼龙膜上，经预杂交后，按0.2 ml/cm2膜加入杂交液和标记的探针（终浓度0.05 mg/L），将杂交袋排尽气泡封口后，置68 摇床中杂交1820 h，取出杂交膜，洗膜后，置 -70 放射自显影24 h，备用。三、rasp21、p53蛋白表

7、达将石蜡包埋的RMS组织块切成厚5m的切片。正常对照组手术切除的眼外肌组织制作冰冻切片，置丙酮液中固定5 min，4 冰箱保存备用。应用生物素-抗生物素蛋白复合物 (avidin biotin complex，ABC)法染色，观察rasp21和p53蛋白产物的表达。另取p21、p53蛋白阳性表达的肾腺癌病例（天津泌尿外科研究所提供）作为阳性对照，用Tris盐酸缓冲液(TBS) 取代第1抗体作为阴性对照。rasp21及p53单克隆抗体panras(132),p53(DO-1)（广东中山试剂公司），抗体稀释度分别为110和120。 结果一、N-ras基因点突变的检测-32pATP标记的寡核苷酸探针

8、与PCR产物的斑点杂交：N-ras癌基因12位密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸（G）发生突变者4例（19.1%，1），13位密码子未见突变，61位密码子第3 个碱基腺嘌呤核苷酸（A）发生突变者5例（23.8%，2），其中2例同时有2个密码子的碱基突变。14例正常眼外肌组织未见基因突变，两组间比较差异有显著性间（P=0.017）。RMS患者癌基因突变率高于正常人。在有基因突变的7例患者中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例。181bp的PCR 产物与突变型寡核苷酸探针（N-ras12）进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点（13，10为突变阳性病例）2115 bp的PCR产物与突变型寡核苷酸探针（

9、N-ras61）进行斑点杂交，基因突变者显示放射斑点（13，5，6为突变阳性病例）二、rasp21、p53蛋白免疫组织化学检测21例眼眶RMS中，免疫组织化学检测p21蛋白阳性表达增强者9例（42.9%），阳性细胞胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色（3），p21蛋白阳性表达位于胞浆或胞膜；p53蛋白阳性表达增强者16例（76.2%），表现为细胞核呈棕黄色（4）。p21及p53蛋白阳性表达同时增强者9例，14例正常眼外肌组织均无rasp21、p53蛋白的阳性表达增强，两组比较差异有非常显著性（P=5.01210-6），说明RMS患者p21，p53蛋白阳性表达率高于正常人。3rasp21蛋白阳性细胞的

10、细胞核呈蓝色，胞浆或胞膜呈棕黄色免疫组织化学染色4004P53蛋白阳性细胞的胞核呈蓝色，免疫组织化学染色400讨论一、眼眶RMS N-ras基因点突变有关RMS 癌基因蛋白的表达，国外已有文献报道，但结果尚不一致。Stratton等2在对21例RMS研究中发现5例ras癌基因突变。Bos等3在RMS细胞系研究中也发现ras癌基因突变。Mulligan等4对241例肿瘤进行了p53基因分析，发现RMS中p53位点等位基因缺失。而Felix等5在6例RMS研究中检测到2例p53基因突变。有关ras家族基因点突变的文献报道较多，主要在第12、13和61位密码子，导致其蛋白产物p21基因的结构异常，并

11、与细胞癌变有关。笔者应用突变型特异性寡核苷酸探针及rasp21、p53单克隆抗体，对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织和14例正常人眼外肌组织分别探查N-ras癌基因点突变及rasp21、p53蛋白的表达。斑点杂交结果显示，4例眼眶肿瘤组织表现为N-ras基因12密码子第2个碱基鸟嘌呤核苷酸（G）的突变，5例眼眶肿瘤组织表现为61密码子第3个碱基腺嘌呤核苷酸（A）的突变，其中2例同时含有2个密码子的碱基突变，突变率为33.3%，与文献报道相似。7例N-ras 基因点突变的眼眶肿瘤组织中，胚胎型RMS 6例，多形性RMS 1例，腺泡型RMS则未发生突变。胚胎型RMS 发生点突变占大多数，似乎点突变更

12、多发生于胚胎型RMS，这是由于从RMS的病理组织学分型来看，胚胎型RMS占60%6，所以其发生N-ras基因点突变的人数自然较其他2型RMS多。文献报道5 例ras基因突变均发生在胚胎型RMS2，因此认为可能是由于其他二型RMS 占全部肿瘤的比例比较小的缘故。二、眼眶RMS rasp21、p53蛋白表达本研究应用p21,p53单克隆抗体对21例石蜡包埋的眼眶RMS组织进行免疫组织化学分析，检测眼眶RMS组织中p21,p53基因蛋白的异常表达情况。结果发现，p53蛋白阳性表达16例，p21蛋白阳性表达9例（p53亦同时阳性），均阴性5例，两种表达一致性检验2= 4.84，P0.05，说明有一致性

13、；两者差异检验，2M=5.14，P0.05，p53蛋白阳性表达率高于p21。显示在检测眼眶RMS时，p53蛋白阳性表达率较p21高。为消除假阳性的可能，同时观察肿瘤外其他成分，未见阳性反应。提示p21、p53蛋白阳性表达增强，说明突变的ras和p53编码的蛋白在眼眶RMS发生、发展过程中起重要作用。尤其是p53蛋白阳性表达作用更为明显。本组结果显示，p21与p53蛋白可同时阳性表达， 证实了肿瘤多基因协同作用的学说。（本文3，4见插页第16页）作者单位：张虹(300211 天津医科大学第二医院眼科)宋国祥(300211 天津医科大学第二医院眼科)张淑敏(天津泌尿外科研究所)畅继武(天津泌尿外科

14、研究所)张维铭(天津医科大学分子生物学实验中心)余虹(天津医科大学分子生物学实验中心)参考文献1.李凤鸣，主编眼科全书北京：人民卫生出版社，1996.1164-1165.2.Stratton MR, Fisher C, Gusterson BA, et al.Detection of point mutations in N-ras and K-ras genes of human embryonal rhabdomyosarcomas using oligonucleotide probes and the polymerase chain reaction.Cancer Res,1989,

15、49:6324-6337.3.Bos JL, Verlaan-de Vries M, Jansen AM,et al.Three different mutations in codon 61 of the human N-ras gene detected by synthetic oligonucleotide hybridization.Nucleic Acids Res,1984,12:9155-9163.4.Mulligan LM, Matlashewski GJ, Scrable HJ, et al. Machanisms of p53 loss in human sarcomas.Proc Natl Acad S