禽流感病毒(H5N1)血凝素特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其ELISA捕获法的建立_图文

1、第一军医大学硕士学位论文禽流感病毒(H5N1血凝素特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其ELISA捕获法的建立姓名:廖志勇申请学位级别:硕士专业:免疫学指导教师:车小燕20070523 第一部分禽流感病毒抗原的制备与鉴定 A B C图ll IFA鉴定昆虫细胞表达的重组H5蛋白(x200 Fig.1-Immunofluorescenceidentificationofthe expression ofrecombinantH5protein in infected High Five insect cells(x200A:H5Bacmidtransfected Hi曲Five cells treate

2、d with standard H5antiserum:B:H5Bacmidtransfected High Five cells treated with standard H7/H9antiserum: C:High Five cells treated with standard H5antiserum 表达重组H5蛋白的Hi曲Five细胞,与禽流感病毒H5亚型标准抗血清作用呈特异的绿色荧光(图l一1A,细胞膜和细胞浆均有着色,与H7亚型标准抗血清不结合(图1,l B:Hi曲Five细胞与H9哑型标准抗血清也不结合,免疫荧光图与H7亚型标准抗血清同,故略去。对照的正常High Five细

3、胞,与H5哑型标准抗血清不结合(图ll C。3.2重组H5蛋白的SDSPAGE电泳和免疫印迹结果SDSPAGE电泳结果显示,莺组H5蛋白的含量在与Ni离子亲和柱结合|j后存在差异。提示在杆状病毒体系表达的重组H5蛋白带有His标记,能结合到Ni柱上,但经自然或变性条件纯化得到的产物中均有非目的蛋白存在,不能得到特异的重组H5蛋白(图略。收集表达重组H5蛋白的High Five细胞,进行超声处理后取上清电泳并转印,免疫印迹结果【81(图l一2显示该七清能与H5亚型标准抗血清及鼠源抗His单抗结合,在约66kDa处呈现强阳性反应条带,表明在High Five细胞表达的重组H5蛋白分子量与预期大小一

4、致,且具有抗原性;由于重组H5蛋白构象的原因,蛋白与Ni离子亲和柱不结合,因此不能得到纯化的蛋白,但SDSPAGE电泳结果显示表达重组H5蛋白的High Five细胞超声处理后的上清80%为目的蛋白,故将HighFive细胞超声处理后的上清直接用于免疫动物。6硕士学位论文 图12免疫印迹鉴定重组his.H5蛋白抗原性1:鸡抗禽流感病毒H5亚型标准血清;2:鸡抗禽流感病毒H7亚型标准血清;3:鸡抗禽流感病毒H9亚型标准血清;4:小鼠抗his单抗;5:正常鸡血清Western blot analysis of antigenicity of hisH5fusion proteins Fig.41:

5、Chicken antiH5standard sera;2:Chicken antiH7standard sera;3:Chicken antiH9standard sera;4:Mouse antihis mAb;5:Normal chicken sera33重组H5蛋白及天然H5血凝素的血凝滴度测定血凝试验结果显示,正常Hi曲Five细胞超声上清以及PBS对照均不使豚鼠红细胞发生凝集,而重组H5蛋白能使豚鼠红细胞发生凝集,血凝滴度达l:128;三个批次的天然H5血凝素的血凝滴度则分别为l:l024、l:l024和1:256。3.41-15基因的质粒的酶切鉴定 图1-3pVAXl一tpA-9

6、7一H5质粒酶切鉴定Fig.13Identification ofplasmid pVAXltpA一97一H5 l:pVAXl一tpA-97一H5digested by Kpn I(3.5and1.2kb;2:pVAXl一tpA-97一H5 digested by Hind m(4.7kbl:3:lkb DNA Ladder7第一部分禽流感病毒抗原的制备与鉴定H5基因的质粒经Kpn I酶切释放3.5kb和1.2kb大小片段,经Hind III酶切得到4.7kb线性化质粒,通过分析pVAXl.tpA一97一H5质粒核酸序列中的酶切位点,证实该结果与预期相符,见图l一3。3.5对照质粒转染293细

7、胞的Xgal染色鉴定xgal染色结果(图1.4显示,带有LacZ报告基因的对照质粒转染293细胞,加入X.gal染液反应后,图A和B视野中分别有约30%和20%细胞呈特异性蓝色,表明LacZ基因经质粒载体lz启动子激活后,成功表达B一半乳糖苷酶,与底物x唔al反应显色,而A和B的区别在于转染质粒的量不同,分别为3岭和l峙,而正常293细胞均尤显色。结果表明pVAXI真核表达载体的转染效率较高。 A B C图l_4携带报告基因的质粒转染293细胞的x-gal染色鉴定Fig.144Xgal staining analysis ofthe p-gaiactosidaseexpression of29

8、3cells transfected by the control plasmid with reporter geneA、B:plasmid with Bgalactosidase gene-transfected293cells treated withXgal(x200;C:control293cells treated with Xgai(x200、3.6H5基因的质粒转染细胞的免疫荧光鉴定IFA结果(图l一5显示,H5基因的质粒转染后的293细胞加入H5N1病毒免疫的鸡血清后,视野中大部分细胞的胞膜及胞浆均出现特异性的绿色荧光,而正常293细胞均呈阴性染色,表明H5基因的质粒转染细胞

9、后表达的H5血凝素能与H5N1病毒免疫血清特异性结合,具有较好的抗原性,可用于免疫动物。硕士学位论文 A B图l一5IFA鉴定H5基因的质粒转染的293细胞上H5血凝素表达Fig.15Immunofluoresc2nce assayoftheH5hemagglutinin expressionof293cellstransfected by plasmid pVAXl一tpA-97一H5A:pVAXl一tpA一97一H5plasmid-transfected293cells treated with H5N1 virus-immunized fowl serum(x200.B:293cells

10、 treated with H5N1virusimmunizedfowl serum(x2004讨论本部分研究的目的是制备H5NI禽流感病毒血凝素抗原,用于免疫动物。血凝素抗原的制备有多种方法,为了使获得的抗原尽可能地接近自然状态下的血凝素,同时考虑到安全性及操作的简便性,实验中选择了商品化粗提抗原、DNA质粒以及基因重组蛋白共三种形式的血凝素抗原。1.利用速度梯度离心得到病毒天然抗原的方法较为简便,但灭活处理对病毒抗原性质有无影响尚不明确。对获得的3个批次天然H5血凝素进行血凝滴度测定,其血凝效价最高达到1:1024,表明灭活处理后的天然H5血凝素保持了良好的血凝活性,提示病毒抗原与血凝活性

11、相关的抗原决定簇保存完好,有助于诱导产生具有血凝抑制活性的抗体。2.携带H5血凝素基因的DNA质粒对实验人员和环境没有危险性,可用于制备针对某一亚型血凝素的特异性抗体91,但其免疫效果仍受质粒载体、免疫佐剂等因素的影响“”。本研究制备了携带H5全长基因的真核表达质粒pVAXltpA一97一H5作为免疫原。Xgal染色试验表明携带报告基因的pVAXI真核表达载体具有良好的转染效率,有利于外源基因的表达。免疫荧光试验结果证实,pVAXI.tpA-97一H5转染后的表达产物能与H5N1病毒免疫血清特异性结合,提示H5基因的质粒具有良好的抗原性。3.杆状病毒体系表达血凝素抗原9 第三部分禽流感病毒Hj

12、抗原检测方法的建立 幽3一l10组有血凝抑制活性的单抗配对检测不同稀释度的天然H5血凝素Fig.3-1The detection of H5hemgglutinin by ten matched pairs of hemagglutination inhibitionmAbs表3.110组有血凝抑制活性的单抗配对检测6株不同稀释度的H5NI病毒Tab.3-1The detectionof six strains ofH5N1virusesbytenmatched pairs ofhemagglutinationinhibition mAbs3.1.2双抗体夹心抗原捕获ELISA的建立硕士学位论

13、文以H5M9和H5M11-HRP分别作为捕获单抗和测定单抗建立双单抗夹心捕获抗原ELISA,经方阵滴定法确定,捕获抗体的包被浓度为20pg/ml,HRP.酶标抗体工作浓度为1:500时较好。3.1.3检测灵敏度以上述方法,检测梯度稀释的天然H5血凝素和H5N1病毒液,以及作为阴性对照的稀释液。结果显示,上述双抗体夹心抗原捕获ELISA的检测灵敏度较好,检测天然H5血凝素和H5N1病毒液A/Vietnam/3028/04时的最低检测限约为1/32血凝单位,见图32。 图3-2有血凝抑制活性单抗为基础的双抗体夹心抗原捕获ELISA检测天然H5血凝素和H5NI病毒液Fig.3-2Standard cnlve and detection limit ofdouble antibody sandwich c印ture ELI