抗白色念珠菌中药小分子的发现及相关机制研究

1、抗白色念珠菌中药小分子的发现及相关机制研究白色念珠菌是严重危害免疫缺陷人群的病原性真菌,其发病率呈上升趋势。当前临床上可用的抗真菌药物仅仅局限于多烯类（两性霉素B）,唑类（氟康唑等）,棘白菌素类（卡泊芬净等）等三类药物,抗真菌药物的靶点只有细胞膜的麦角固醇（ergosterol）代谢和细胞壁的0-1,3-葡聚糖（B-1,3-glucan）合成两个。药物的毒副作用,耐药性,生物利用度低等问题都使得抗真菌药物治疗的效果不佳,而生物被膜的出现使这种情况更加恶化,因此,开发新的抗真菌药物成为一项迫在眉睫的使命。植物来源的小分子化合物一直是抗细菌,抗真菌和抗肿瘤药物的主来源之一。中草药来源的天然小分子在

2、抗真菌活性方面的研究越来越多,靶点也多种多样。因此,对源于中药的小分子化合物库进行筛选,不仅容易发现新的先导化合物,也可能找到新的抗真菌药物的靶点。因此,本研究主要聚焦于中药来源的天然小分子的抗白色念珠菌活性。通过初步筛选,我们发现了9个具有抗真菌活性的小分子化合物/提取物,分别为血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱,黄山药皂苷提取物,紫草素,土荆皮乙酸,补骨脂乙素,蓝雪醌,厚朴酚,和厚朴酚。血竭素高氯酸盐和盐酸石蒜碱为首次发现具有抗白色念珠菌活性。由于其他化合物的抗白色念珠菌活性具有较详细报道,因此我们选择血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱和黄山药皂苷提取物进行了初步研究。所用菌株为白色念珠菌标准株SC531

3、4。主要方法有时间杀伤曲线,形态转变,生物被膜的形成和发育（XTT实验），黏附实验,磷脂酶产生,生物被膜中表多糖（exopolysaccharide,EPS）测定,PI染色（流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测），活性氧种类（reactiveoxygenspecies,ROS）测定,cAMP补救实验，细胞毒性实验,线虫毒性试验,山梨醇补救实验等。血竭素高氯酸盐的最小抑制浓度（MI。为64仙M,为抑制真菌活性。它能抑制白色念珠菌的生物被膜的形成,也能抑制已经形成的生物被膜的发育,以及白色念珠菌酵母型向菌丝型生长的转变。血竭素高氯酸盐能降低细胞表面疏水性,白色念珠菌细胞对材料和培养细胞的黏附。它还能抑

4、制细胞外磷脂酶的产生，以及成熟生物被膜中EPS的产生。而其对哺乳动物细胞的毒性和对秀丽隐杆线虫的毒性都较小。其对菌丝型生长的抑制可能是通过降低细胞内cAM睐发挥作用的。盐酸石蒜碱也为抑菌活性，MIC为64仙M它也能抑制酵母型向菌丝型的转变抑制生物被膜的形成和发育,抑制白色念珠菌对材料表面的黏附。细胞外磷脂酶的产生和EPS勺产生也能被盐酸石蒜碱抑制，而cAMF&可能在其活性中发挥重要作用,而其对哺乳动物细胞的毒性也较小。黄山药皂苷提取物为杀菌活性，MIC与最小杀菌浓度（MFC均为64g/mL。它也能抑制白色念珠菌的形态转变,抑制白色念珠菌生物被膜的形成和发育抑制白色念珠菌的黏附，细胞外磷脂酶的产

5、生以及成熟生物被膜中的EPS的产生，其对哺乳动物细胞的毒性较小,其抑制细胞增殖半数抑制浓度（IC50）高于其抑制白色念珠菌的MIC。黄山药皂苷提取物能够对细胞膜造成损伤,导致碘化丙啶（PI）进入细胞核并发出红色荧光。黄山药皂甘提取物还能显著提高细胞内ROS勺产生，而加入N-乙酰-半胱氨酸（NAC则能抑制其活性。随后,我们对黄山药皂苷提取物的主要成分,薯蓣皂苷的抗真菌活性进行的初步评估。薯藤皂甘具有很强的抗白色念珠菌活性，MIC和MFC匀为4仙g/mL,它同样能抑制生物被膜的形成和发育,抑制白色念珠菌的形态转变,细胞外磷脂酶的分泌等毒力因子。它还能造成细胞膜通透性的升高，但是不能诱导细胞内ROS

6、勺产生。时间杀菌曲线也与黄山药皂苷提取物有所不同。薯藤皂甘和黄山药皂甘提取物，在时间杀菌曲线和RO明导产生方面的差异使我们推测,在黄山药皂苷提取物中,还存在有其他抗念珠菌活性的化合物,或者能与薯蓣皂苷产生协同作用的化合物。通过对其中几种主要的皂苷成分进行抗真菌活性筛选,我们发现纤细薯蓣皂苷为另一抗真菌活性化合物。纤细薯藤皂甘的抗真菌活性为抑制真菌生长，其MIC为16仙g/mLo纤细薯藤皂苷同样能抑制生物被膜的形成和发育,抑制形态转变和黏附。cAM辞卜救实马表明，其抗生物被膜的活性可能是通过降低细胞内cAM发现的。PI染色试验证实,纤细薯蓣皂苷能提高细胞膜的通透性,而流式细胞仪检测表明，纤细薯藤皂甘能造成白色念珠菌细胞内ROS生增加，这与黄山药皂甘提取物的作用相一致。山梨醇补救实验表明,它很可能是通过作用于细胞壁发挥抗真菌作用。另外,纤细薯蓣皂苷不仅能与薯蓣皂苷产生协同抗真菌活性,而且能与两性霉素B产生协同作用,而与氟康唑和醋酸卡泊芬净均能产生相加作用。本研究首次发现了血竭素高氯酸盐,盐酸石蒜碱和黄山药皂苷提取物的抗白色念珠菌活性,初步探索了它们对于白色念珠菌的黏附,形态转变,生物被膜形成以及细胞外磷脂酶分泌等毒力因子的抑制作用,以及对哺乳动物细胞的