中药丹参酮对复合痴呆大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯

1、中药丹参酮对复合痴呆大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯        【摘要】  目的探讨丹参酮对D-半乳糖- A1-40致复合痴呆模型大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）表达的影响。方法 实验动物随机分成3组：AD模型组：采用1.25% D-半乳糖腹腔注射致衰老结合双侧海马齿状回背侧微量注射凝聚态A1-40复合造模方法，拟建立AD样学习记忆功能障碍的痴呆动物模型；

2、丹参酮组：AD大鼠造模24 h后给予丹参酮50 mg/(kg·d)；溶媒对照组：与AD大鼠同法注射等量生理盐水。 采用免疫组织化学和酶组织化学方法，分别观察大鼠海马内iNOS和AChE表达的变化。结果模型组AChE阳性纤维受损，光密度下降（含阳性面积百分比和光密度）；iNOS-ir细胞数显著升高，平均光密度增强；与对照组比较差异极显著（P0.01）。丹参酮处理后，iNOS-ir细胞数明显减少，光密度也下降；AChE阳性神经纤维密度增强；与模型组比较差异有显著性意义（P0.01）。结论丹参酮改善D-半乳糖- A1-40致复合痴呆大鼠学习记忆障碍的作用机制，可能与保护脑内胆碱能神经，以及

3、降低海马内iNOS的表达有关。 【关键词】  丹参酮； D-半乳糖-淀粉样肽蛋白诱导型一氧化氮合酶 乙酰胆碱酯酶大鼠Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of tanshinone on levels of iNOS and AChE in hippocampus of dementia model rats induced by D-galactose combination with A1-40.MethodsThe experimental animals were randomly divided into three gro

4、ups. In AD model group 1.25%D-galactose in combination with microinjection of 10 g incubated amyloid -peptide  1-40 (A1-40) into the dorsal blade of the dentale gyrus in the hippocampus of rat. In tanshinone therapeutic group,after establishment of rat AD model for 24 h , tanshinone50 mg/(kg

5、83;d)was given for 14 days by gastric perfusion. In solvent control group,the rats were treated with the same method as AD rats but received injection of the same physiological saline. The expression of iNOS and AChE in rat hippocampus were respectively observed by immunohistochemical and histochemi

6、cal  methods .Results AChE positive nervous fibers, optical density of AChE positive nervous fibers of AD rats in the hippocampus were  decreased.iNOS-ir cells count and the average optical density of AD rats in the hippocampus were significantly increased as compared with solvent con

7、trol group. After tanshinone treatment, iNOS -ir cell count and the optical density were obviously decreased, optical density of AChE-positive nervous fibers were significantly increased as compared with AD model group.ConclusionMechanism of tanshinone to improve learning and memory impairment in de

8、mentia model rats induced by D-galactose in combination with A1-40 might be related to protection of cholinergic nerves in brain and decrease of iNOS expression in hippocampus .Key words：Tanshinone;  D-galactose;  -amyloid peptide protein (A);  Inducible nitric oxide synthase（iNOS）；&#

9、160; Acetylcholinesterase（AChE） ;  Rats     老人常见的痴呆病因是阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）1，而AD的病因、发病机制尚未完全清楚。AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱（acetylcholine ，ACh），一氧化氮（nitric oxide, NO）及诱导型一氧化氮合酶（inductive nitric oxide synthase, iNOS）24 。有报道，丹参酮A和B能减少小鼠短暂的（急性）局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用5，还能改善缺血再灌注损伤

10、小鼠和东莨菪碱（抗胆碱药）诱发的空间行为缺陷小鼠的学习、记忆障碍6。但就丹参酮对D-半乳糖- A1-40诱发复合痴呆（记忆障碍）病变大鼠的作用未见报道。因此，本研究采用腹腔注射1.25%D-半乳糖致衰老加双侧海马微量注射凝聚态A1-40诱发AD样复合痴呆（记忆障碍）大鼠模型，以观察海马内ACh的降解酶乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase, AChE）和iNOS表达的变化，同时观察丹参酮改善大鼠学习记忆的神经化学机制。1  材料1.1  动物选用清洁二级spraque-Dawley(SD)雄性大鼠共45只，体质量250 g左右（华中科技大学同济医学院实验动

11、物学部提供）。实验动物随机分成3组：AD模型组15只;丹参酮治疗组20只；溶媒对照组10只。1.2  试剂及仪器丹参酮（华中科技大学同济医学院临床药教研室惠赠），A1-40、DAB（Sigma公司，美国），iNOS多克隆兔抗鼠抗体（Santa Cruz公司），生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根酶标记链霉卵白素（S-A/HRP）工作液（北京中山生物有限公司）。江湾型脑立体定位仪（上海川沙花木农机厂），Y-型水迷宫（医学院药物所研制），AO恒冷箱切片机（美国AO公司），HPIAS-1000彩色病理图文分析系统（华中科技大学同济医学院清屏影像工程公司组装）。2  方法2.1

12、60; 造模方法全部大鼠在实验前应用水迷宫试验进行学习记忆功能的检测，选取学习记忆功能正常的大鼠随机配组实验；每组动物造模完成后，分别采用水迷宫试验鉴定动物模型。2.1.1  动物学习记忆功能的测试采用Y-型水迷宫试验监测大鼠学习记忆功能。记录大鼠平均逃避潜伏期（从入水起点至寻找到阶梯出水的时间）和进入盲端的错误次数（逃避错误频率，次/3min）。预训练4 d，2次/d，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180s。训练第1天让大鼠自由游泳，第24天训练时，试验者可引导大鼠进入安全通道。    按照Zealonga 5级评分法，在造

13、模大鼠清醒后，立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取评分为2分及以上造模大鼠入围实验。2.1.2  D-半乳糖腹腔注射参照7，8以无菌生理盐水配制1.25% D-半乳糖溶液。AD模型组和丹参酮治疗组按50 mg·kg-1·d-1的标准计算相应的D-半乳糖盐液量，腹腔注射，连续6 周。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法腹腔注射等量的生理盐水。2.1.3  A1-40海马注射在D-半乳糖连续处理6周后的第2天，施行A1-4

14、0海马注射。即：大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开1.5 cm长切口，暴露颅骨和前囱。用牙科钻头钻开颅骨，在海马齿状回背侧（参照大鼠脑立体定位图谱，定位坐标为前囟后3.5 mm，脑正中线旁开2.0 mm，深度2.7 mm）缓慢注入A1-40各1 l（10 g A1-40溶于1 l无菌生理盐水，用前37下孵育1周，使其凝聚老化）。注射完毕后留针5 min（保证溶液充分扩散），然后缓慢起针。蜡封闭针孔，撒消炎粉止血消炎，缝合皮肤。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法，于海马区注射等量的生理盐水1 l。术后将大鼠放回鼠笼中常规饲养。并肌注青霉素抗感染（40万

15、u/d·只，连续7 d）。丹参酮治疗组在D-半乳糖-A1-40复合造模后24 h给予丹参酮9，丹参酮均按50 mg·kg-1·d-1溶于5 ml玉米油中灌胃。溶媒对照组及AD模型组仅以等量玉米油灌胃。各连续14 d。2.2  染色方法实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注温的生理盐水100 ml，随即快注冷的4%多聚甲醛固定液（4，pH7.3）100 ml，然后慢速灌注多聚甲醛液250 ml。开颅取脑，依次入20%、30%蔗糖磷酸缓冲液（PB，0.1 mol/L，pH7.4）中浸透，制作海马冠状恒冷箱连续切片，片厚25 m，PB接片，收集

16、全部切片，做形态学各项指标检测。2.2.1  AChE组织化学法部分切片入改良的karnovsky-Roots孵育液，37孵育2h，以0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液（pH7.6）漂洗切片，DAB/H2O2-硫酸镍铵染色液显色。阳性神经纤维呈灰蓝色。2.2.2  iNOS免疫活性的表达（SP法）部分切片用0.25%triton X-100，37预处理30 min。转入正常小牛血清室温20 min（封闭非特异抗原）。切片先后入一抗（iNOS，1100）4孵育72 h，二抗室温30 min，SP复合物（S-A/HRP）反应30 min，DAB/H2O2-硫酸镍铵液显

17、色。阴性对照以PBS替换一级抗体。2.3  统计方法每只实验大鼠随机选5张切片，10×20光镜视野下标定海马切片CA1和CA4区。利用HPIAS-1000彩色图像分析系统分别测定海马各亚区的面积（S）和AChE阳性神经纤维的面积（S）（阳性面积百分比：S/S）。以及iNOS-Ir神经元计数和平均光密度测定。所有的数据以±s表示，采用SPSS12.0 统计软件进行单因素方差分析和多组间均数比较，以P0.05为差异有显著性意义。1         3  结果  

18、;  经水迷宫试验，证明本研究全部入围实验大鼠造模前学习记忆功能均正常。AD模型组大鼠出现23分级神经功能障碍，但无瘫痪或死亡动物。同时，发生严重的学习记忆功能障碍；经丹参酮后大鼠学习记忆功能显著改善（限于篇幅详细测定结果资料略）。3.1  丹参酮对海马内iNOS-ir细胞表达的影响溶媒对照组海马CA4及CA1区，有少量iNOS-ir细胞表达。AD模型组海马内明显可见局部神经元受损(CA4)，其周边出现大量增生的iNOS-ir细胞，其形态多样，类似于胶质细胞，突起明显，胞体及突起均有iNOS-ir着色。CA1区有可见少量此类细胞。丹参酮治疗组海马内各区iNOS-ir细胞的表

19、达明显低于模型组（结果见表1）。表1  丹参酮对D-半乳糖-A1-40处理大鼠后海马内iNOS表达的影响（略）3.2  丹参酮对海马内ACh能神经的影响溶媒对照组海马CA1及CA4区（层）富含AChE阳性纤维末梢细密网，膨体丰富。CA1及CA4以多形细胞层、辐射层和分子层丰富，锥体细胞层最少。在CA4分子层AChE阳性纤维较密集，颗粒细胞和多形细胞层则较少。各区可见少量的AChE弱阳性反应细胞。AD模型组CA1及CA4区AChE阳性纤维着色浅，膨体少，纤维网稀疏。注射区深部出现AChE阳性纤维受损迹像。丹参酮治疗组部分模型组给予丹参酮处理后，海马内各区AChE阳性纤维的着色

20、及密度界于上二组之间，即受损程度明显减轻。    图像分析测定海马CA4、CA1区AChE阳性纤维密度及所占面积，经统计学分析。结果见表2。表2  丹参酮对D-半乳糖-A1-40处理大鼠后海马内AChE表达的影响（略）4  讨论4.1  痴呆动物模型的评价AD主要行为改变为记忆能力下降和认知功能障碍，主要病理改变有老年斑和神经原纤维缠结1。因此，建立模拟AD行为改变和病理特征的痴呆动物模型，对于AD治疗药物筛选，发病机制的研究有重要意义。本研究动物模型采用复合AD动物模型。即：在腹腔注射D-半乳糖致衰老的基础上于大鼠海马内微量注射A1

21、-40模拟复制AD痴呆动物模型。具有以下特点：与人类AD发病机制有相似性，能仿真出AD的行为学改变；能模拟复制出AD的主要病理改变；与临床病症相仿；技术稳定可复制。通过水迷宫试验评价，证明D-半乳糖与A1-40复合诱发大鼠AD模型较D-半乳糖8或A单一造模9优越。该模型更适用于AD样老年痴呆发病机制及治疗药物筛选的研究。4.2  中枢胆碱能神经与AD中枢胆碱能神经系统通过边缘系统和大脑皮层调节学习和记忆过程。在边缘系统中隔区内侧核和斜角带核发出的胆碱能神经纤维，经穹窿投射到海马，这条胆碱能通路与学习记忆密切相关，切断海马-穹窿投射神经纤维，可导致学习记忆障碍。  

22、  AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱，在皮层、尾核中ChAC、AChE活性显著降低，同时主要发出胆碱能神经纤维向皮层投射的基底神经节的神经元也受损，ACh释放减少。本研究，D-半乳糖-A1-40复合造模后，海马内各亚区AChE阳性神经纤维也明显减少，提示A可以损害胆碱能神经元。治疗组大鼠用丹参酮（50 mg·kg-1·d-1）处理后，海马内A的表达明显减少，而AChE酶活性增加，表明丹参酮能提高记忆功能的机制，可能是通过降低A的表达，保护海马胆碱能神经免遭损害来实现的。4.3  iNOS与ADAD患者脑内iNOS-ir神经元明显增多，局部可见大

23、量神经元受损，与A的过度沉积直接相关，提示iNOS可能与AD有关10。    NO是与学习记忆有关的逆行信息分子，参与海马长时程增强（LTP）的形成。但是，高浓度的NO则有神经毒作用。AD患者脑内A异常增多，A通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞从而引起iNOS介导的NO大量产生而杀伤脑内神经元11。    本研究表明，D-半乳糖与A1-40复合造模后，海马各亚区iNOS-ir神经元表达明显增高，同时局部神经元大量受损。丹参酮干预治疗组大鼠则可减少iNOS的表达，和减轻脑内局部神经元的受损。由此提示，丹参酮改善大鼠学习记忆的作用机制，其中

24、还有是通过抑制海马内iNOS的表达，而保护脑局部神经元免遭损害来实现的。【】  1茹立强，王才源，殷光甫.神经基础M.北京：清华大学出版社，2004:351.2苗建亭，李柱一，林 宏,等.-淀粉样蛋白对大鼠学习记忆功能及脑胆碱乙酰转移酶和生长抑素表达的影响J.神经科学杂志，2003，19（1）：23.3Yamaguchi Y,Matsuno T, Kawashima S.Antiamnesic effects of azaindoliizinone derivative ZSET845 on impaired learning and decreased ChAT activity induced by amyloid-25-35 in the ratJ.Brain Res, 2002，945: 259.4Tanzi RE, Moir RD, Wagner SL, et al. Alzheimers abeis peptide the many roads to perdition. J.Neuron,2004,43(5):605.5Lam BY ,Lo AC,Sun X,et al.Ne