酶分子的改造与修饰

1、第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰 第一节第一节 酶分子修饰酶分子修饰第二节第二节 酶分子定向进化酶分子定向进化 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰第一节第一节 酶分子修饰酶分子修饰p一、采用蛋白质工程技术修饰酶一、采用蛋白质工程技术修饰酶p二、酶法有限水解二、酶法有限水解p三、氨基酸置换修饰三、氨基酸置换修饰p四、亲和标记修饰四、亲和标记修饰p五、大分子结合修饰五、大分子结合修饰第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰限制酶大规模应用的原因限制酶大规模应用的原因p1)细胞外稳定性差；细胞外稳定性差；p2)酶活性不够高；酶活性不够高；p3)具有抗原性。

2、具有抗原性。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰改变酶特性的方法改变酶特性的方法p 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。然酶的活性。p 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。达到改造酶的目的。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰一、采用蛋白质工程技术修饰酶一、采用蛋白质工程技术修饰酶p1.基因修饰技术基因修饰技术p（1）定位突变技术）定位突变技术p（2）盒式突变技术）盒式突变技术p2.蛋白质工程修饰酶分子蛋白质工程修饰酶分子第四章第四章 酶分子的改造和

3、修饰酶分子的改造和修饰1.基因修饰技术基因修饰技术p（1）定位突变技术）定位突变技术p蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的第一、第二码决定的，只要改变其中的第一、第二个（或两个）就可以改变氨基酸。个（或两个）就可以改变氨基酸。p噬菌体噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在的生活周期有二个阶段，在噬菌体质粒中其基因组为单链，侵入宿噬菌体质粒中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。主细胞以后，通过复制以双链形式存在。p将待研究的基因插入载体将待研究的基因插入载体M13，制得单，制得单链模板，人工合成引物，合成相应的互链模板，

4、人工合成引物，合成相应的互补链，用补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。连接酶连接成闭环双链分子。p经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，复制，因此就得到两种类型，因此就得到两种类型，含错配碱含错配碱基的就为突变型。基的就为突变型。再转入合适的表达系再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。统合成突变型蛋白质。 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰1.基因修饰技术基因修饰技术p(2)盒式突变技术盒式突变技术p盒式突变盒式突变1985年年Wells提出的一种提出的一种基因修饰技术基因修饰技术盒式突变，一次可盒式突变，一次可以在一个位点上产生以在一个位

5、点上产生20种不同氨基酸种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行氨基酸进行“饱和性饱和性”分析。分析。p利用定位突变在拟改造的氨基酸密码利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。理就可以得到多种突变型基因。 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰第四章第四章 酶分子的改

6、造和修饰酶分子的改造和修饰盒式突变盒式突变p枯草杆菌蛋白酶是加酶洗涤剂中使用的主要蛋白水解酶，枯草杆菌蛋白酶是加酶洗涤剂中使用的主要蛋白水解酶，由于它易于氧化失活，因此洗涤剂中添加的漂白剂大大降由于它易于氧化失活，因此洗涤剂中添加的漂白剂大大降低了该酶的效力。低了该酶的效力。p这个酶活性中心这个酶活性中心Ser - 221 的邻位为的邻位为Met222 ，由于，由于Met222 的存在，使该酶易被氧化失活，于是设法定点的存在，使该酶易被氧化失活，于是设法定点突变，将此氨基酸进行取代。突变，将此氨基酸进行取代。p但哪种氨基酸取代它最好，要求既要改善对氧化的稳定性，但哪种氨基酸取代它最好，要求既要

7、改善对氧化的稳定性，又要不使酶活性降低。又要不使酶活性降低。p于是采用盒式突变技术，每于是采用盒式突变技术，每5 个氨基酸取代的质粒进行一个氨基酸取代的质粒进行一组实验，组实验，4 组实验就将其余组实验就将其余19 种氨基酸分别取代种氨基酸分别取代Met 一一222 ，得出最佳实验结果。，得出最佳实验结果。 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰二、酶法有限水解二、酶法有限水解p用适当的方法将酶蛋白肽链进行有限水解，既可保留或增用适当的方法将酶蛋白肽链进行有限水解，既可保留或增强酶的活性又可降低其抗原性，对蛋白酶的应用极为有利。强酶的活性又可降低其抗原性，对蛋白酶的应用极为有利。p

8、体内酶原的激活便是一种自发的有限水解修饰。在体外也体内酶原的激活便是一种自发的有限水解修饰。在体外也可使肽链水解，以达到修饰的目的。可使肽链水解，以达到修饰的目的。p例：胰蛋白酶原用蛋白酶修饰除去一个六肽，即可显示出例：胰蛋白酶原用蛋白酶修饰除去一个六肽，即可显示出催化活力。催化活力。p天冬氨酸酶用胰蛋白酶水解，切去天冬氨酸酶用胰蛋白酶水解，切去C端十多个氨基酸的肽端十多个氨基酸的肽段后，活力提高段后，活力提高4.5倍。倍。p除去一部分氨基酸或肽段，可使酶的空间构型发生某些细除去一部分氨基酸或肽段，可使酶的空间构型发生某些细微的变化从而提高酶的催化能力。微的变化从而提高酶的催化能力。第四章第四

9、章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰三、氨基酸置换修饰三、氨基酸置换修饰p酶的催化能力极其稳定性主要依赖于酶的空间结构，酶蛋酶的催化能力极其稳定性主要依赖于酶的空间结构，酶蛋白的空间结构主要靠副键（二硫键、盐键、酯键、疏水键白的空间结构主要靠副键（二硫键、盐键、酯键、疏水键和范德华力等）来维持，而各个副键的的形成是由不同的和范德华力等）来维持，而各个副键的的形成是由不同的氨基酸所带基团决定的。氨基酸所带基团决定的。p如半胱氨酸残基上的巯基可形成二硫键，碱性氨基酸残基如半胱氨酸残基上的巯基可形成二硫键，碱性氨基酸残基上的氨基和酸性氨基酸的羟基可形成盐基等。上的氨基和酸性氨基酸的羟基可形成盐基

10、等。p若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则可能引若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则可能引起酶蛋白空间结构的某些改变。这种修饰方法成为氨基酸起酶蛋白空间结构的某些改变。这种修饰方法成为氨基酸置换修饰。置换修饰。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰p氨基酸置换氨基酸置换p化学修饰：化学修饰：难度大，成本高，专一性差，而且要对难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。p定点修饰。定点修饰。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰四、亲和标记修饰四、亲和标记修饰p亲和标记：亲和

11、标记：指亲和试剂只与作用部位的特定指亲和试剂只与作用部位的特定基团发生作用，而不与作用部位以外的同类基团发生作用，而不与作用部位以外的同类或其它基团发生作用。或其它基团发生作用。p亲和标记修饰：亲和标记修饰：借助亲和作用对目的分子进借助亲和作用对目的分子进行标记的方法。先将能与蛋白质亲和的分子行标记的方法。先将能与蛋白质亲和的分子(如底物、抗原等如底物、抗原等)与目的蛋白活性部位特与目的蛋白活性部位特异性、非共价键、异性、非共价键、可逆性可逆性结合，再通过具体结合，再通过具体的化学反应使亲和分子上的活性基团的化学反应使亲和分子上的活性基团共价共价结结合到活性部位附近的氨基酸残基上。合到活性部位

12、附近的氨基酸残基上。 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰亲和标记修饰亲和标记修饰p例如，对以芳香族氨基酸为特异的基质的胰凝乳例如，对以芳香族氨基酸为特异的基质的胰凝乳蛋白酶，用基质类似物的蛋白酶，用基质类似物的TPCK（L-1-甲苯磺酰甲苯磺酰胺胺-2-苯乙基氯甲基酮）与之反应，则苯乙基氯甲基酮）与之反应，则TPCK在在苯丙氨酸之侧链部分苯丙氨酸之侧链部分与胰凝乳蛋白酶进行特异的与胰凝乳蛋白酶进行特异的结合，与结合，与氯化甲酮部分氯化甲酮部分反应，这使在活性部分存反应，这使在活性部分存在的组氨酸残基有选择地在的组氨酸残基有选择地烷基化。烷基化。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶

13、分子的改造和修饰五、大分子结合修饰五、大分子结合修饰p非共价修饰非共价修饰p使用一些能与酶使用一些能与酶非共价非共价地相互作用而又能有效地地相互作用而又能有效地保护酶保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过过氢键氢键固定在酶分子表面，也能通过固定在酶分子表面，也能通过氢键氢键有效地与外部有效地与外部水相连，从而水相连，从而保护酶的活力保护酶的活力。p一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。通过调节酶的微环境来保护酶的活力。p另一类添加物就是蛋

14、白质。蛋白质分子之间相互作用时，另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了其稳定性也就增加了。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰五、大分子结合修饰五、大分子结合修饰p共价修饰共价修饰p用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过过共价键共价键连接于酶分子的表面，连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。形成一层覆盖层。p例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低，不仅可以降

15、低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。p每分子核糖核酸酶与每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；倍；p每分子胰凝乳蛋白酶与每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的到原有酶活力的5.1倍倍 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰五、大分子结合修饰五、大分子结合修饰p大分子修饰大分子修饰( (共价共价) )的过

16、程的过程p修饰剂的选择：修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。p修饰剂的活化：修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前

17、一般需要经过活化，然后才可团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。以与酶分子的某侧链基团进行反应。 p修饰：修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。修饰。 p分离：分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分需要通过

18、凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰p聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。天然超氧物歧化酶与经大分子修饰后的半衰期比较天然超氧物歧化酶与经大分子修饰后的半衰期比较第四

19、章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰第二节第二节 酶分子定向进化酶分子定向进化p96p一、基本原理一、基本原理p二、定向进化的应用二、定向进化的应用第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰酶分子定向进化酶分子定向进化p不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制创造特殊的条件，模拟自然进化机制( (随机突变、重随机突变、重组和自然选择组和自然选择) )，在体外改造酶基因，并定向选择出，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。所需性质的突变酶。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和

20、修饰一、基本原理一、基本原理p在待进化酶基因的在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合酶不具有聚合酶不具有33 55校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶选出所需性质的优化酶( (或蛋白质或蛋白质) )，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。p定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。p定向进化定向进化= =随机突变

21、随机突变+ +选择。选择。前者是人为引发的，后者虽相当于前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的下进行的第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰定向进化的选择策略定向进化的选择策略p1.易错易错PCR 技术技术p2. DNA改组改组第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰1.易错易错PCR 技术技术定义：定义：从单一基因出发，通过改变从单一基因出发，通过改变PCR

22、PCR反应条反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。误而引起基因突变。过程：过程：双链双链DNADNA变性（解链；变性（解链；85859595） 引物与单链引物与单链DNADNA结合（退火；结合（退火；50507070 ） 引物延伸（半保留复制；引物延伸（半保留复制；70707575 ）条件：条件：降低降低PCR中中DNA复制的精确度复制的精确度 采用采用Taq DNA聚合酶聚合酶 添加添加MnMn2 2（降低聚合酶的特异性）（降低聚合酶的特异性） 替代替代MgMg2 2（稳定非互补的碱基对）（稳定非互补的碱基对） 调整调整4 4种底物的

23、浓度使不平衡种底物的浓度使不平衡 （dATP/dTTP/dCTP/dGTP)dATP/dTTP/dCTP/dGTP)第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰 由于由于Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右；个突变左右； 加入加入dTTP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每5个碱基对个碱基对1个突变。个突变。 当然，错配率并不是越高越好，一般认为，理想当然，错配

24、率并不是越高越好，一般认为，理想的突变频率为每个基因的突变频率为每个基因1.55个点突变。个点突变。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰易错易错PCR 技术技术p如：在非水相（二甲基甲酰铵如：在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体的活性获得成功，所得突变体PC3在在60%和和85%的的DMF中中, 催化效率催化效率kcat/Ki分别是野生分别是野生酶的酶的256和和131倍倍, 比活性提高了比活性提高了157倍倍. 将将PC3再进行再进行两个循环的定向进化两个循环的定向进化, 产生的突变体产生的突变

25、体13M的的kcat/Ki比比PC3高高3倍倍(在在60%DMF中中), 比野生酶高比野生酶高471倍倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属故属于无性进化（于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（时，一般适用于较小的基因片段（800 bp）. 第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰酶分子体外定向进化原理酶分子体外定向进化原理第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰2. DNA改组改组pDNA改组又称有性改组又称有性PCR(sexual PCR)p获得

26、存在不同基因的正突变；获得存在不同基因的正突变；p将正突变结合在一起形成新的突将正突变结合在一起形成新的突变基因库；变基因库；p从正突变基因库中分离出来的从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶片段用脱氧核糖核酸酶随机切割，得到随机片段；随机切割，得到随机片段；p随机片段经过不加引物的多次随机片段经过不加引物的多次PCR循环，循环，随机片段之间互为随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同片全长的基因，这导致来自不同片段之间的重组。段之间的重组。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰DNA改组改组p该策略的目的是创

27、造将亲本基因群中的突变尽可能组合的该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会机会, 导致更大的变异导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶最终获取最佳突变组合的酶. p可使酶的可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体个或更多的已优化性质合为一体.第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰二、定向进化的应用二、定向进化的应用p1.提高酶分子的催化活力提高酶分子的催化活力p2.提高酶分子的稳定性提高酶分子的稳定性p3.适应人工环境中提高酶活力或稳定性适应人工环境中提高酶活力或稳定性p4.提高读物转移性和增加对新底物催化活力提高读物转移性和增加对新底物催化活力p5.对映体选择性的

28、定向进化对映体选择性的定向进化p6.变换催化反应的专一性变换催化反应的专一性第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰1.提高酶分子的催化活力提高酶分子的催化活力pL天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马酸和氨生成酸和氨生成L-天冬氨酸。天冬氨酸。L-天冬氨酸在医药、食天冬氨酸在医药、食品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一步证实，在这种条件下通过酶的步证实，在这种条件下通过酶的合理化设计合理化设计来进一

29、来进一步提高酶活力具有一定困难。为此，采用步提高酶活力具有一定困难。为此，采用定向进化定向进化的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰p根据定向进化的基本思想，确定了易错根据定向进化的基本思想，确定了易错PCR筛筛选选(优势突变重组优势突变重组筛选筛选)n的实验路线。的实验路线。p共进行了共进行了4轮易错轮易错PCR，每一轮易错，每一轮易错PCR约筛选约筛选了了3000个菌落。个菌落。p最终得到了一株酶活力提高最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。倍的突变体。p对天然酶和进化酶的酶学性质进行

30、了分析，结果对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产因此更适合于工业化生产L天冬氨酸。天冬氨酸。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰p进化酶基因测序结果表明共发生了进化酶基因测序结果表明共发生了7个碱基突变，其中个碱基突变，其中3个点突变引起了氨基酸的改变：个点突变引起了氨基酸的改变：Asn217Lys，Thr233Arg，Val367Gly（缬氨酸、甘氨酸）。（缬氨酸、甘氨酸）。pThr（苏氨酸）位于亚基间相互作用的界面上，距离（苏氨酸）位于亚基间相互作用的界面上，距

31、离Lys32715nm以内，推测突变后的以内，推测突变后的Arg与底物与底物COOH的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体从而引起亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体从而引起了进化酶了进化酶K m的下降和的下降和Kcat值的提高。值的提高。pL天冬氨酸酶活性位点的重要催化残基没有改变，暗示天冬氨酸酶活性位点的重要催化残基没有改变，暗示该进化酶的催化机理与天然酶相同。该进化酶的催化机理与天然酶相同。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰2.提高酶分子的稳定性提高酶分子的稳定性p一般单氨基酸残基突

32、变造成酶的最适温度的升高一般单氨基酸残基突变造成酶的最适温度的升高为为12，而更多的提高比较罕见。，而更多的提高比较罕见。p例如已经确定的例如已经确定的T4溶菌酶溶菌酶11个不同的单点突变个不同的单点突变株将酶最适温度提高的范围是株将酶最适温度提高的范围是08一一14；p已发现的已发现的8株大肠杆菌核酸酶株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，单点突变中，7株最适温度提高了株最适温度提高了o742，而另一个氨，而另一个氨基酸取代可能因为填充了蛋白质分子内部的一个基酸取代可能因为填充了蛋白质分子内部的一个空穴而导致最适温度产生了空穴而导致最适温度产生了78的提高。的提高。第四章第四章 酶分子的改造和修饰

33、酶分子的改造和修饰三、适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化三、适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化p利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速率率p而天然酶在有机溶剂中，即使有时能保持天然构象也极易而天然酶在有机溶剂中，即使有时能保持天然构象也极易失活失活p因此在这种酶分子的因此在这种酶分子的应用环境中应用环境中对酶分子定向进化就十分对酶分子定向进化就十分必要。必要。p例如枯草杆菌蛋白酶在例如枯草杆菌蛋白酶在60DMF（二甲基甲酰胺）（二甲基甲酰胺）中的定中的定向进化，提高了酶的活力和稳定性。又如利用定向进化和向进化，提高了酶的活力和稳定性。又如利用定向进化和基因重组，创造了对硝基苄基酯酶在基因重组，创造了对硝基苄基酯酶在DMF中使合成抗生中使合成抗生素中间体脱保护，在素中间体脱保护，在30DMF中酶活力提高了中酶活力提高了100倍。倍。第四章第四章 酶分子的改造和修饰酶分子的改造和修饰四、提高底物的专一性和增加四、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化对新底物催化活力的进化p增加底物专一性，或增加对新底物催化活力可以增加底物专一性，或增加对新底物催化活力可以使酶更加适应工业化生产。使酶更加适应工业化生产。p如：利用定向化将一个半乳糖酶改造成以果糖为如：利用定向化将