抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究

1、抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究    唐华曹雪涛于益芝朱学军银平章张明徽 摘要目的：探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞(DC)体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以-gal为模拟抗原，以转染有LacZ基因并稳定表达-gal的淋巴瘤细胞E22为肿瘤细胞模型，用携带编码-gal的LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)转染小鼠骨髓DC，检测转染的效率及LacZ基因修饰DC刺激T细胞增殖的能力，观察皮下免疫LacZ基因修饰DC后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及诱导产生CTL和抵抗E22细胞再

2、攻击的能力。结果：LacZ基因修饰后24、48、72 h，均能检测到80以上的DC表达-gal，此基因修饰的DC可有效刺激同基因型小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应；将其皮下免疫小鼠1 w 后再接种E22细胞，小鼠的存活期较其他DC免疫小鼠显著延长，但对B16黑色素瘤细胞的攻击无免疫保护作用。此外，LacZ基因修饰的DC免疫小鼠的引流淋巴结细胞数量显著增加，且产生了针对E22的而非EL-4或B16的特异性CTL。结论：腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的DC能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。 关键词树突状细胞抗原基因修饰腺病毒CTL疫苗 中国图书分类号R392.1 Induction of speci

3、fic antitumor immune responses by vaccination with tumor antigen gene-modified dendritic cells TANG Hua,CAO Xue-Tao,YU Yi-Zhi et al. Department of Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433 AbstractObjective:To investigate whether vaccination with antigen gene-modified dendritic c

4、ells(DC) could induce specific antitumor immunity,using -gal as a model tumor antigen.Methods:DC were generated from bone marrow in the presence of mGM-CSF(3.3 ng/ml) and mIL-4(1 ng/ml)，and then,transfected with a recombinant adenovirus encoding LacZ gene(AdLacZ). The efficacy of LacZ gene transfect

5、ion and T cell stimulating activity of DC were detected.The number and cell subsets of draining lymph nodes,CTL activity of the mice s.c vaccinated with DC were observed.Results:Visual X-gal staining showed that more than 80 DCs were transfected with LacZ gene.Vaccination with those genetically modi

6、fied DC could increase the cell number of draining lymph node and induce -gal specific CTL most significantly. After vaccination with the -gal gene-modified DC,the survival time of the mice challenged with wild-type E22 cells (a clone of EL-4 lymphoma expressing -gal)1 week later was prolonged more

7、potently than that of the mice vaccinated with other DCs.No proteckive effect was observed in the mice challenged with B16 melanoma cells.Conclusion:The results demonstrated that specific antitumor immune responses cound be induced efficiently by vaccination with tumor antigen gene-modified DC. Key

8、wordsDendritic cellAntigenGene modificationAdenovirusCTLVaccine 树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前所知的是功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Nat-ive T cell) 的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)，在免疫应答中处于中心地位。近年来体外大量扩增DC的方法日益成熟，使DC用于肿瘤治疗受到重视1，2。Porgador 等用MHC I类分子限制的肿瘤抗原多肽体外致敏的DC免疫小鼠，不但诱导产生了特异性CTL，同时也使小鼠获得了抵抗肿瘤再攻击的能力3，4。本室曾

9、用GM-CSF基因修饰的DC经肿瘤抗原体外致敏后或与肿瘤细胞融合后免疫小鼠，使小鼠产生了更强的特异性抗肿瘤免疫反应5，6。若将肿瘤抗原基因转染至DC并使之持续表达，有可能更有效地发挥DC的抗原提呈作用，而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。Chen等曾以LacZ基因作为模拟的抗原基因、以其表达产物-半乳糖苷酶(-gal)作为模拟的抗原并以转染了LacZ基因、能稳定表达-gal的胸腺淋巴瘤细胞EL-4的亚克隆E22为模型研究抗原特异性抗肿瘤免疫反应7，鉴于将-gal为模拟抗原的实验体系稳定、简便、明确，因此，我们利用E22为肿瘤细胞模型，通过携带有编码LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)的

10、介导，探讨腺病毒介导的抗原基因修饰的DC能否诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，为以DC为基础的肿瘤主动性免疫基因治疗提供实验依据。 1材料与方法 1.1动物和细胞株C57BL/6小鼠(H-2b)，68周龄，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。胸腺淋巴瘤细胞株EL-4(为C57BL/6小鼠来源)以及稳定表达-gal的IL-4细胞亚克隆细胞株E22(来自转移有编码LacZ基因的EL-4，用含400 g/ml G418的RPMI 1640培养基选择培养，X-gal染色率100%)均由美国克利夫兰医学中心陈卫博士惠赠；B16为C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞株，本室常规传代。 1.2主要试

11、剂携带编码LacZ基因重组腺病毒AdLacZ)及E1区缺陷的腺病毒Ad5，由日本癌症研究所基金会Hamada博士惠赠；大鼠抗小鼠单抗CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1.1-PE和FITC标记的羊抗大鼠荧光二抗均购自PharMingen公司，抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia、FcR、和33D1的单抗为本室从常规培养的杂交瘤上清中纯化所得，mGM-CSF和mIL-4均购自Sigma公司，同位素3H-TdR、Na251CrO4均自Amersham公司。 1.3骨髓树突状细胞的培养参考Inaba的方法略作修改8，取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH4Cl溶去红

12、细胞，PBS洗2次后，用大鼠抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia和FcR混合单抗液重悬，4孵育45 min，洗涤后加入低毒兔补体(110稀释)，37介溶45 min，PBS洗2次后，用含重组mGM-CSF（3.3 ng/ml）和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基于6孔培养板上培养(1×106 cell/ml)。第3天，轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，补入新鲜的含同样浓度mGM-CSF和mIL-4的完全培养基，第6天收集非粘附细胞和疏松粘附的增殖性树突状细胞聚集体，于培养瓶中继续培养2 d，收集悬浮的细胞即为DC。 1.4DC的基因修饰及修饰后的DC对

13、小鼠的免疫收集第8天的DC，调整至1×106 ml-1于6孔培养板上，以MOI值50加入AdLacZ或Ad5，37，1 h后补加正常培养液，24 h后，收集并洗涤2次。X-gal染色以明确转染效率及转染后24、48和72 h的AdLacZ表达情况。以3.5×105/只给小鼠右后肢股外侧皮下免疫。      1.5DC刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力的检测经上述基因修饰的DC，加入丝裂霉素C，终浓度为25 g/ml，于34孵箱中孵育45 min，洗2次，作为刺激细胞。取经灭活E22细胞免疫1 w后的C57BL/6小鼠的脾脏，制成单细胞悬液

14、，Tris-NH4Cl溶去红细胞，洗2次后注入尼龙毛柱，置37孵育1 h，预热的PBS(37)冲洗出非粘附细胞，作为T细胞即反应细胞。将DC与T细胞按1100、1330、11 000的比例在96孔培养板上培养72 h，于结束培养前16 h加入3H-TdR(1 Ci/孔)，常规收集细胞，置WALLAC1409液闪仪上检测，计算cpm值。 1.6DC免疫的小鼠引流区淋巴结细胞数量的变化及组分的FACS分析DC免疫1 w后，取小鼠右后腹股沟浅淋巴结，制备成单细胞悬液，细胞总计数，并用大鼠抗小鼠CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1.1-PE、33D1单抗于4标记30 min后洗2次，对于需

15、间接标记的33D1样本管，加入FITC-羊抗大鼠单抗，4标记30 min后洗2次，流式细胞仪(FACS Calibur,BD)检测细胞表型，分析淋巴细胞组分。 1.7CTL的体外诱导及杀伤活性的检测DC免疫7 d后取脾脏T细胞(5×106 ml-1)与灭活的E22细胞按201的比例，在含IL-2 100U/ml的RPMI 1640完全培养基中培养，第5天收集活细胞作为效应细胞，Na251CrO4标记1 h的E22或EL-4或B16细胞作为靶细胞，以1001、501、251不同的效靶比，用51Cr 4 h释放法检测CTL的活性，同时设最大释放组和自然释放组。以下式计算杀伤率： 1.8D

16、C免疫后的保护作用于DC免疫1 w后，皮下接种E22细胞(2×107/只)或B16(1×105/只)，每组10只，观察小鼠的存活期。 2结果 2.1腺病毒介导的LacZ基因修饰DC的效率X-gal染色表明，腺病毒介导的LacZ基因修饰后24、48、72 h，80%以上DC细胞蓝染；而对照组即没有用LacZ转染的DC，不见细胞着色，表明腺病毒能有效介导模拟抗原-gal基因转染至DC。 2.2LacZ基因修饰DC的抗原提呈能力如图1所示，LacZ基因修饰DC刺激同基因型鼠脾脏T细胞的增殖水平明显高于未用LacZ基因修饰的DC和对照腺病毒Ad5感染的DC(P0.05)。 图1DC

17、刺激同基因型小鼠T细胞的增殖能力 Fig.1Syngeneic T cell stimulatory function of DC 2.3LacZ基因修饰的DC免疫小鼠后引流区淋巴结细胞数量及组分的变化如图2所示AdLacZ转染的DC免疫后，小鼠的淋巴结细胞数可达2.21×107，是其他各对照组的35倍，而其淋巴细胞的组分没有明显的变化(结果未显示)。 图2DC免疫的小鼠引流淋巴结细胞数 Fig.2The cell number of draining lymph nodes in mice vaccinated with DC 2.4LacZ基因修饰的DC免疫小鼠后诱导的-gal特

18、异性CTL活性如图3所示，LacZ基因修饰DC免疫的小鼠脾脏细胞体外诱导的CTL，对稳定表达-gal的E22细胞具有显著的杀伤活性，而对EL-4细胞和B16细胞无杀伤活性；对照腺病毒Ad5感染的DC组、正常DC组及PBS组的小鼠的脾脏细胞未能诱导出显著杀伤E22细胞的CTL，与LacZ基因修饰DC免疫小鼠的CTL相比差异显著(P0.05)。 图3抗原基因修饰的DC免疫小鼠的CTL杀伤活性 Fig.3CTL cytotoxicity of mice vaccinated with antigen gene-modified DC 2.5LacZ基因转染的DC免疫小鼠后诱导机体产生的特异性免疫保护

19、作用用AdLacZ转染的DC免疫的小鼠可以抵抗E22细胞的再攻击，表现为使接种E22细胞的荷瘤小鼠的存活期显著延长，但对于接种B16黑色素瘤细胞的荷瘤小鼠的存活期无任何延长(图4)。对照腺病毒Ad5感染的DC免疫组、正常DC免疫组及PBS组均无免疫保护作用。本结果表明模拟抗原-gal基因修饰的DC免疫后可诱导出抗原特异性免疫保护作用。 图4DC免疫后荷瘤小鼠的存活期 Fig.4The survival time of tumor-bearing mice vaccinated with antigen gene-modified DC 3讨论 人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现与确认，对肿瘤的

20、免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段，如抗原基因免疫等对机体就具有一定的免疫保护作用；进一步研究表明，抗原基因免疫尽管能诱导机体产生一定程度的抗肿瘤免疫反应，但其效果仍不能令人满意9。将肿瘤抗原与抗原提呈细胞(主要是DC)相结合，通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应是肿瘤免疫治疗研究方面的热门课题。目前多用体外抗原致敏的DC免疫机体以诱导产生抗原特异性的抗肿瘤免疫反应，致敏DC的方法多用外源性肿瘤抗原，如肿瘤抗原多肽、肿瘤冻融抗原、肿瘤抗原蛋白等。本研究以-gal作为模拟抗原，探讨抗原基因修饰的DC对机体特异性免疫反应的诱导作用，可为肿瘤的免疫治疗提供新的途径。

21、 实验结果显示，AdLacZ可以高效转染DC，并可持续表达-gal。用AdLacZ转染的DC免疫的小鼠，其引流区淋巴结细胞数显著高于非转染组，提示DC已迁移至淋巴结并激活了免疫细胞，使其发生了增殖。体外的混合淋巴细胞反应的结果显示，LacZ基因修饰的DC可以刺激E22细胞(表达-gal)免疫小鼠的脾脏T细胞明显增殖，其刺激活性显著高于未用LacZ基因修饰的DC，提示LacZ基因修饰的DC有效地提高了模拟抗原-gal。同时用LacZ基因修饰的DC免疫小鼠后，可以诱导产生较高水平的E22特异性CTL杀伤活性，而对EL-4细胞和B16细胞无杀伤活性，证实了LacZ基因修饰DC后，DC提呈了模拟抗原(

22、-gal)，诱导产生了针对模拟抗原-gal的特异性免疫反应。用LacZ基因修饰的DC免疫的小鼠，可抵抗野生型E22细胞的再攻击，而不能使接种B16的小鼠的存活期延长，说明LacZ基因修饰DC的免疫使小鼠获得了特异的抵抗E22肿瘤细胞的免疫保护力。上述结果提示，用携带编码肿瘤抗原基因的腺病毒作为载体转染DC，不但可以使DC得到高效转染，而且可持续表达该抗原，使抗原在DC内得到有效加工处理，以多个抗原表位提呈给T细胞，用其免疫后可以使机体产生显著的特异性抗肿瘤免疫反应。 本研究结果也表明，将APC与肿瘤抗原及其基因结合起来用于肿瘤的主动特异性免疫治疗，具有一定的临床应用前景，而加强对DC等APC生

23、物学特性和功能的研究以及发现更多的肿瘤抗原及其基因将为此奠定理论基础，具有重要的应用价值。此外，由于人们也发现一些肿瘤具有共享抗原(Shared antigen)的现象，因此构建一种表达肿瘤抗原或其多肽的腺病毒载体有可能会适用于多种肿瘤的治疗，该方面值得深入研究。      资金项目：本课题受国家自然科学基金重点课题(39730420)和国家杰出青年科学基金(39825123)资助 作者简介：唐华，男，30岁，硕士，主治医师，主要研究肿瘤的生物治疗 作者单位：唐华银平章河南省人民医院生物治疗中心，郑州 450003；曹雪涛于益芝朱学军张明徽第二军医大学免疫教研室，上海 200433 指导教师，曹雪涛，男，35岁，教授，博士生导师，主要研究肿瘤免疫 参考文献 1曹雪涛.树突状细胞与肿瘤的免疫治疗和基因治疗.中国肿瘤生物治疗杂志，1998；5(2)：82 2Banchereau J,Steinman R M.Dendritic cells and the control of immunity.Nature,1998;392(19):245 3Porgador A,Gilboa E.Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I restricted pepti