几种微血管形态学观测方法间的比较分析_图文

1、技术方法几种微血管形态学观测方法间的比较分析张卫光1,冯凤芝2,夏家骝1,田珑1,严宗毅1(1.北京大学医学部解剖学与组织胚胎学系,北京100083;2.中国医学科学院北京协和医科大学北京协和医院,北京100730【摘要】目的:通过对6种微血管形态学观测方法的比较,使研究者能够选择出最适宜的实验方法。方法:针对每一种方法,进行实验方法的简介和分析。结果:6种方法间各有所长。结论:研究者应根据实验的要求和条件,选择出一种方法或几种方法相结合,以达到研究的目的。【关键词】微血管;形态学;方法学【中图分类号】R322【文献标识码】A【文章编号】1001-165X(200304-0408-03The

2、comparison and analysis among a few methods on microvascular observation and measureZHA N G Wei2guang3,FEN G Feng2z hi,XIA Jia2liu,et al.3Depart ment of A natomy and histoembrology,Peking U niversity Health Science Center,Beijing100083,China【Abstract】Objective:To select a optimal method on microvasc

3、ular observation and measure via comparisonand analysis among6kinds of morphological methods.Methods:Each of methods was briefly introduced and an2alyzed.R esults:Each of methods has its own advantages and disadvantages.Conclusion:According to differentexperimental need and condition,researchers sho

4、uld select a suitable method or integrate several methods.【K ey w ords】microvessel;morphology;methodology微血管通常是指管径小于300m的血管,主要包括微动脉、微静脉和毛细血管等,是研究组织和器官微循环的基础。而人肉眼的最小分辨率为200m,因此对微血管的观察和测量需借助显微镜利用一些特殊的方法进行。近年来,随着内皮型一氧化氮合酶(en2 dothelial nitric oxide synthase,eNOS等血管活性物质影响微血管舒缩功能研究的深入,对观察和测量微血管管径的实验方法和技术

5、的要求也不断地提高。本文针对目前实验室中经常采用的几种方法,作一比较分析其利弊,旨在为实验研究者提供更好的帮助。1组织切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosine,H-E染色法方法:取材后,组织经常规石蜡或冰冻切片,切片厚210m,入水后先后经苏木精和伊红染色,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。分析:H-E染色法是实验室最常用的方法。其优点是方法简单快捷,如果是冰冻切片,30min或更短的时间内即可知道结果,而且该技术容易掌握,花费低。光镜下,血管及内皮细胞的形态保持良好,细胞核染成兰色,细胞浆染成红色。其缺点是:组织(如石蜡【收稿日期】2002-07-21【基金项目】国家自然科学

6、基金(30170244和“985”跨学科项目资助【作者简介】张卫光(1970-,男,山东聊城市人,硕士,讲师,主要从事微血管结构和功能研究,Tel:(01062092466,E2mail:zhangook 。切片经酒精脱水后收缩较严重(约10%15%;因为切片很薄,所显示的微血管均为断面,血管的连续性差,其中绝大多数的断面并不是与微血管长轴相垂直的横断面,会出现多种情况影响测量的结果(图1 。图1不同的情况下所形成的4种微血管断面示意图Fig.1These sketch showed four kinds of microvessel sec2tions under different con

7、ditions2墨汁灌注组织学切片法方法:例如心脏,左、右冠状动脉或主动脉(动物插管,墨汁灌注后24h取材,组织以火棉胶或混合蜡1(凡士林蜂蜡石蜡=123配制包埋,推拉式火棉胶切片机切片,切片厚度可在20200m之间选择。二甲苯脱蜡,中性树胶封固。分析:墨汁灌注后,光镜下观察到的黑色线条,显示的为微血管内径。该方法不仅可显示微动脉、微静脉,还能很好地显示毛细血管;并因为切片较厚,各种血管的延续性也很清楚;借助目镜测微尺或图像分析,还可较准确测量毛细血管内径及密度,是研究微血管状态的较理想方法(见图2。此外,如果切片经H-E 染色后,还可观察组织和微血管的结构。该方法的主84CHIN ESE J

8、OURNAL OF CL INICAL ANATOM YVOL.21NO.32003要缺点为实验时间长,如采用火棉胶包埋约12个月,混合蜡包埋15d 左右。临床上广泛应用的血管造影以及实验室中采用的血管内乳胶或铅丹等的灌注,均因显示时间太短或灌注物的颗粒较大,而无法显示组织和器官的微血管。墨汁则因其颗粒小、无渗透性、反差好、经济等优点,在实验研究中得以较广泛地应用 。图2墨汁灌注后显示的大鼠心肌微血管(黑色线条×33Fig.2Rat myocardial microvessel (black lines per 2fused with Chinese ink.×333树酯灌

9、注扫描电镜观察方法:动脉插管,一般灌注以甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、过氧化苯甲酰和二甲基苯胺的混合液或其他的如ABS (丙烯腈、丁二烯、苯乙烯灌注液,在灌注液凝固成型后,将标本置于盐酸中12周。冲洗腐蚀的组织,待干燥后固定于样本托上,喷镀后在扫描电子显微镜下观察测量微血管的管径 。图3ABS 灌注扫描电镜下的心肌微静脉(V Fig.3Myocardial venules (V ,perfused with ABS under scanning electron microscopy.分析:树脂灌注扫描电镜观察是测量和观察微血管的较理想的方法,从管径较大的微动脉和微静脉到管径很小的毛细血管,均能

10、很清楚地显示出血管的内径。 该方法最突出的优点是能够观察到各级微血管的分支、分布、交通及其空间的立体构筑情况,通过观察血管铸型上内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核的压迹,还能区分开微动脉和微静脉,并能够准确加以测量见(图3。但由于在电镜观察前已把微血管周围的组织腐蚀掉了,因此对于观察微血管与周围组织的关系上极为不利。4超薄切片透射电镜观察方法:低温取材、固定,丙酮脱水,环氧树脂618(Epon 618包埋,聚合后行超薄切片,醋酸双氧铀和铅染液电子染色。透射电子显微镜下观察和测量组织微血管的管径。分析:透射电镜下,能够准确观察和测量出管径<50m 的微血管,尤其是毛细血管的管腔及其血管内皮细胞的

11、状况见(图4。如为免疫电镜方法,还可显示出血管内皮细胞的分泌功能情况。但经放大1000倍以上,尤其是在放大5000倍以上时,组织中管径>100m 的微血管全貌大多显示不完整。因其切片更薄,测量微血管的管径时,如同H -E 方法,误差可能会比较大。此外,该方法所需的费用大,应用较为受限 。图4透射电镜照片显示心肌毛细血管(EN.内皮细胞核,L.管腔×10000Fig.4Myocardial capillary under transmission elec 2tron microscopy (EN.endothelial nuclear ,L.lumen .×10000

12、5免疫组织化学染色法方法:4%多聚甲醛固定,取材,铺片或行冰冻切片或石蜡切片。标本入缓冲液后,经羊血清去电荷和H 2O 2去过氧化物酶,再滴加抗(如因子、CD 34或血管内皮生长因子等、抗或HRP 标记的链酶卵白素(亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin -bi 2otin peroxidase complex mothod ,ABC 法,二氨基联苯胺(diaminobenzidine ,DAB 显色。切片脱水、透明、封固。分析:在研究微血管时,免疫组织化学染色法是目前国内外最常用的方法之一,其原理主要是针对血管内皮细胞或血管平滑肌细胞所分泌的大分子物质(如904中国临床解剖学杂志2

13、003年第21卷第3期eNOS 、CD 342等或膜受体(如血管内皮生长因子的受体的抗原抗体反应,在经DAB 等显色剂显色后,能直接反映血管内皮细胞等的分泌功能及其某种血管活性物质的分布情况。如果该方法再结合以苏木精等的复染,还可观察到微血管的舒张/收缩变化趋势见(图5,但应该注意的是,苏木精使细胞核着的兰色,可部分掩盖免疫组化的显色。而利用免疫组织化学染色法测量微血管的管径时,其缺点类似于H -E 染色。此外,由于微血管的血管平滑肌细胞较少甚至缺如,内皮 细胞在无细胞核的部位所形成的血管管壁非常薄,由此对该方法的技术要求也比较高。图5大鼠心肌微血管血管内皮生长因子免疫组织化学染色(苏木精复染

14、,显示一管径约40m 的微血管(箭头的分支情况×50Fig.5Fig.5A 40m wide rat myocardiol mi 2crovessel and its branches stained by V EGF immuno 2histochemistry ×50此外,在显示微血管时,与免疫组织化学染色法相似的方法还有冰冻切片酶组织化学方法和原位杂交法。酶组织化学的原理主要是针对红细胞或血管内皮细胞中的某种酶或其它物质3,如内源性过氧化物酶4等进行酶组织化学反应,来反映微血管的情况,但其特异性较差,显示较细的微血管和毛细血管时不理想。原位杂交的原理是以用标记的DNA

15、 或RNA 为探针,在原位检测组织微血管中,多为血管内皮细胞中的特定核酸序列,它虽然特异性很高,但所需费用偏高。6微导管法方法:微血管置于树胶玻璃微管腔内,循环以37的加氧缓冲液如Krebs 缓冲液(118.3mol NaCl ,4.7mol KCl ,2.5mol CaCl 2,1.2mol MgSO 4,1.2mol NaH 2PO 4,25mol NaHCO 3和11.1mol 葡萄糖。双玻璃微管插管测量微血管内径,并以10-0尼龙单丝证实。以倒置显微镜连接照相机,血管的影象投射在一黑白电视监视器上5。电子分析仪用于测量血管的内径。分析:在国内外条件较好的实验室经常采用此方法进行微血管功

16、能性的研究。其优点为微血管所处的状态与活体近似,能比较客观地反映它们的舒张和收缩情况;所测量的也是微血管的内径,主要为其50200m 之间的微动脉和微静脉。此方法尤其适用于诸如eNOS 、内皮素、血管内皮生长因子等血管活性物质的药理和生理性研究。其缺点是:对管径小于50m 的微血管,尤其是毛细血管的测量不理想;实验用标本要求新鲜,尤其是人的标本难得。此外,与该方法相关的实验设备和技术要求较高,广泛的应用相对困难。由此可见,微血管的形态学观察与测量方法有多种,各有利弊,研究者应根据实验的要求和实验条件,选择出一种方法或几种方法相结合,以达到研究的目的。【参考文献】1陈莉,田珑。软蜡包埋切片显示墨汁灌注的血管J .解剖科学进展,1998,4,273.2李小静,宁金龙,张林等.CD34组化法在瘢痕微血管构筑中的应用研究J .中国烧伤创疡杂志,2000,1,1316.3孔祥玉,赵淑敏,周天启.单宁酸-金属盐联用媒染脑血管的研究J .解剖学杂志,1997,20,53.4戴晓玲,张致身,王元身等