真菌的常规检验法

1、真菌的常规检验法实验室检查：标本采集分离培养直接镜检生化反应染色镜检免疫学试验、临床标本的采集1. 皮肤的角质性物质：毛发、指 （趾）甲、头屑、皮屑 等。2 .各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、 粪便、尿液等。3.血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴 穿刺液等。4 .脓汁及渗出物。、检验方法（一）标本直接检查法不染色标本检查不染色法KOHii：取摘发、皮丿甲畸于载玻片上，加 1d10%20%KOHi&,盖上盖玻片并微加热，使标木透叨 镜下可见他子、菌丝形态染色法：常用革兰染色、乳酸酚棉蓝.墨汁"荧光染色等染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定 KOH容液：本液

2、适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） 水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。微生物学检查步骤： 取患部标本（毛发、皮屑等） 置载玻片加10%NaO（或10%KOH微加温消化-镜检（观察菌丝和孢子）直接镜检的意义 有诊断意义，如浅部真菌病等； 通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种如假丝酵母菌的厚膜孢子等； 判断某些真菌种的致病性等，如皮肤癣菌、曲霉等。直接镜检的局限性： 阴性结果不能排除真菌感染； 有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑

3、结果应作复查或用其他检验方法鉴定。2. 染色标本检查（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。（2 ）乳酸酚棉蓝染色（3）糖原染色：又称过碘Schiff （简称PAS或PASH。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红-亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。（4）嗜银染色（GMS :染成黑色（5）粘蛋白卡红染色法（MCS :主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑 色。（6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。（二）培养检查法本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 菌落性质：酵母

4、菌还是霉菌； 菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； 菌落颜色： 病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深; 致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌 菌落不下沉，很少引起开裂。标本培养观察标本T沙保培养基T 观察菌落形态、假菌丝标本T玉米粉琼脂培养基T 观察厚垣孢子2、培养方法接种工具为接种针、接种钩、接种环、接种铲(刀)(1) 试管培养：多用于菌种传代接种与保存。(2) 大培养：用平皿或培养瓶培养。(3) 小培养可观察结构特征及发育的全过程1 )玻片小培养法2 )郭可大钢圈小培养法：材料：培养基、钢环(用铁环或废电线的铝丝制成)载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。钢圈小培养法 先

5、将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开 口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针 取少量材料，接种在培养基表面。将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。 逐日镜检，一般约7d即可长好。根据菌丝和孢子的结构特 点进行真菌类别的鉴定。真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28 C,但深部真菌为 37C。菌落形态是鉴别真菌的判断依 据。动物实验目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药 物对真菌的作用等。如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮 质部位有白色脓疡。（三）真菌的鉴定1. 真菌的生化反应用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。1 ）糖（醇）类发酵试验37 C,观察糖发酵情况。2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基（45 C ）混合，然后在培养基上分别加糖，置25 C孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在 糖周围有生长圈，否则无生长圈。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。3） 同化氮源试验同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。5）