微波超声波辅助肉制品中亚硝酸盐测定的比较研究

1、南 阳 理 工 学 院本科生毕业论文学 院： 生物与化学工程学院 专 业： 食品科学与工程 学 生： 刘云 指导教师： 王冬梅（教授） 完成日期 2014 年 5 月南阳理工学院本科生毕业论文微波、超声波辅助肉制品中亚硝酸盐测定的比较研究 Comparative study on the determination of nitrite in microwave, ultrasonic assisted in meat products总 计： 毕业论文22页表 格： 8个插 图： 8幅南 阳 理 工 学 院 本 科 毕 业 论 文 微波、超声波辅助肉制品中亚硝酸盐测定的比较研究Compara

2、tive study on the determination of nitrite in microwave, ultrasonic assisted in meat products学 院： 生物与化学工程学院 专 业： 食品科学与工程 学 生 姓 名： 刘云 学 号： 105010940025 指 导 教 师： 王冬梅（教授） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2014-5-12 南阳理工学院Nanyang Institute of Technology微波、超声波辅助肉制品中亚硝酸盐测定的比较研究微波、超声波辅助肉制品中亚硝酸盐测定的比较研究食品科学与工程 刘云摘 要本试验以火腿肠为

3、原料通过不同条件下的微波、超声波处理，采用格里斯试剂比色法测定处理后的亚硝酸盐含量，研究了原材料预处理方法对肉制品亚硝酸盐含量测定的影响。结果表明：采用微波、超声波处理样品，均可以增加亚硝酸盐的含量；采用超声波处理时，稀释倍数为25倍，功率为70%，处理时间为10min时亚硝酸盐含量为13.51g，与未处理相比亚硝酸盐的测定数值显著增加，测定值增加量为9.83mg/kg,从而提高检测结果的准确性；而采用微波处理时，稀释倍数为21倍，功率为500w，处理时间为10min时亚硝酸盐含量为3.06g，与未处理相比亚硝酸盐的测定数值有所增加，测定值增加量为0.32mg/kg，从而提高检测结果的准确性；

4、但两者相比，超声波处理后的效果要比微波处理后的效果好得多，两者差值为9.51mg/kg。该试验对提高格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量的准确度有一定的参考价值，并且为此提供了相应的条件要求。关键词 微波；超声波；格里斯；亚硝酸盐Comparative study on the determination of nitrite in microwave, ultrasonic assisted in meat productsFood science and Engineering Liu Yun Abstract：In this experiment, ham sausage as raw ma

5、terials by microwave, ultrasonic treatment under different conditions, by nitrite determination to deal with Griess reagent colorimetric method after the effects of raw materials, pretreatment method for determination of nitrite in meat products. The results show that: the samples were treated by mi

6、crowave, ultrasonic, all can increase the content of nitrite; ultrasonic treatment, dilution ratio was 25, the power is 70%, the processing time for 10min nitrite content was 13.51g, compared with untreated nitrite determination value increased significantly, increase the value of 9.83mg/kg, so as t

7、o improve the detection accuracy of results; and by microwave treatment, dilution ratio was 21, power is 500W, the processing time for 10min nitrite content was 3.06g, compared with untreated nitrite determination value increased, the increased value of 0.32mg/kg, so as to improve the detection accu

8、racy of results; but the two compared, after ultrasonic treatment effect than the microwave the treatment effect is much better, the difference between the two is 9.51mg/kg. The test of determination of nitrite in Griess's reagent colorimetric method accuracy has a certain reference value, and p

9、rovides the corresponding required conditions.Keyword： microwave; ultrasonic; Griess; nitrite目 录1前言11.1亚硝酸盐简介11.1.1食品中添加亚硝酸盐的作用11.1.2食品中添加亚硝酸盐的危害21.1.3亚硝酸盐的国内外研究现状21.2 亚硝酸盐的测定方法31.2.1盐酸萘乙二胺法31.2.2格里斯试剂比色法31.2.3两种方法的比较41.3微波与超声波的简单介绍41.3.1微波的简单介绍41.3.2超声波的简单介绍61.4本课题研究的目的及意义71.4.1本课题研究的内容71.4.2本课题研究的

10、目的71.4.3本课题研究的意义72 材料与方法82.1主要材料与试剂82.2主要仪器与设备82.3试验方法82.3.1 原料的处理82.3.2 亚硝酸钠标准曲线的制作82.3.3 样品亚硝酸钠测定的操作102.4研究方案102.4.1超声波处理102.4.2微波处理112.4.3 两种处理方法的比较123 结果与分析133.1超声波处理133.1.1有机物对亚硝酸盐测定数值的影响133.1.2稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响133.1.3超声波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响143.2微波处理153.2.1有机物对亚硝酸盐测定数值的影响153.2.2稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响163.2

11、.3微波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响173.3两种处理方法的比较184 结论195 参考资料216 致谢221 前言 随着人民生活水平的提高，社会经济的发展，人们对饮食的要求不单单停留在吃饱、吃好，而是越来越注重吃的有健康，吃的有营养。肉制品特别是熟肉制品是人们日常饮食中不可或缺的食品，因此其质量安全不容忽视。亚硝酸盐是熟肉制品的防腐剂和发色剂，适当的添加可以改善肉制品的感官品质以及抑制微生物的生长繁殖。因此，很多国家允许将其作为发色剂、抗氧化剂、防腐剂而限量加入到肉制品中。但是很多不法商贩为了增加和提高肉制品色泽和延长保质期，在配料中加入的亚硝酸盐往往超出国家的标准。亚硝酸盐残留量过高可

12、引起中毒，因而时常有亚硝酸盐中毒事件发生1。 1.1 亚硝酸盐简介亚硝酸盐俗称工业用盐，为一种白色或微黄色结晶，有的为颗粒状粉末，无臭、味微咸涩，易潮解，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，除用于染料生产和某些有机合成、金属表面处理等工业外，在食品生产中亦用作食品着色剂和防腐剂。允许用于肉及肉制品加工中，添加亚硝酸盐可以抑制肉毒芽胞杆菌，并使肉制品呈现鲜红色，但是亚硝酸盐的添加是肉制品中亚硝酸盐残留。我国食品添加剂使用卫生标准规定在肉制品中亚硝酸盐的使用量不得超过0.15g/kg。在肉制品中的最终残留量不得超过50mg/kg，肉罐头中不得超过30mg/kg2。 1.1.1 食品中添加亚硝酸盐的作

13、用（1）色剂作用正常的原料肉在热加工处理后肉的颜色成白色、灰色、淡黄色、添加亚硝酸  钠后肉在热加工的颜色为淡红色，亚硝酸钠与肉制品中肌红蛋白、血红蛋白生成鲜艳、亮红色的亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白而保护颜色，从外观上能给人增加食欲。 （2）抑菌作用亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和产气荚膜杆菌等致病菌的生长繁殖起抑制作用, 其抑菌能力受在肉制品中残留量的浓度及pH值等环境因素影响。 （3） 腌制作用亚硝酸盐添加于腌制肉类中具有增加肉制品风味作用。其对于肉制品的风味可有两个方面的影响：一是产生特殊腌制风味，这是其他辅料所无法取代

14、的；二是防止脂肪氧化酸败，以保持腌制肉制品独有的风味。 （4）  螯合作用在肉制品腌制过程中,亚硝酸盐能使泡胀的胶原蛋白的数量增多,从而增加肉的黏度和弹性,是良好的螯合剂3。1.1.2 食品中添加亚硝酸盐的危害一般在肉制品生产过程中添加亚硝酸钠发色和防腐, 国家对亚硝酸钠添加量有严格的规定, 如果添加量超过国家标准就会超过人体的解毒功能, 从而对人体健康造成不同程度的急性和慢性危害。 （1）急性中毒亚硝酸钠对人的中毒剂量为0.3-0.5g, 致死量为2-3g。正常人血红蛋白含Fe2+, 行使全身组织运送O2和带走CO2的功能。当机体吸收过量亚硝酸钠后, 由于亚硝酸

15、钠具有强的氧化能力, 血红蛋白的Fe2+被氧化成Fe3+,使正常的血红蛋白变成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白失去携氧的能力,造成机体组织缺氧,并对周围血管有扩张作用，因此引起呼吸困难、皮肤发绀、血压下降等症状, 严重者昏迷惊厥、呼吸衰竭而死亡。 （2） 致癌性和致畸性  亚硝酸盐在人体中易与与肉中蛋白质分解产物胺类反应形成亚硝胺, 如二甲胺与亚硝酸作用生成二甲基亚硝胺。亚硝胺是一种强致癌物, 据动物实验, 一次多量或长期摄入都可引起癌症。目前还没有发现能耐受亚硝胺而不致癌的动物。人类的鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌都与亚硝胺有关。亚硝胺在体内微粒体羟化酶作用下, 经过一系

16、列代谢, 形成致癌物,促使自由甲基将核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的鸟嘌呤O6或O7位甲基化, 使细胞产生突变或癌变。胃内还有一类细菌叫硝酸还原菌，也能使亚硝酸盐与胺类物质结合成亚硝胺。权威机构对100多种亚硝胺进行了动物试验，发现其中80多种有致癌性。亚硝酸盐能透过胎盘进入胎儿体内，六个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，据研究表明，五岁儿童发生脑癌的相对危险度增高与母体经食物摄入亚硝酸盐量有关。此外，亚硝酸盐还可通过乳汁进入婴儿体内，造成婴儿机体组织缺氧，皮肤、黏膜出现青紫斑。可见食品中添加亚硝酸盐具有成本低、用量少、效果好等特点，对防止食品变质和保持腌肉制品的色、香、味有独特的作

17、用。但是亚硝酸盐在使用过程中的添加量要严格执行国家的限量标准，例如，腌腊肉制品类、酱卤肉制品类、油炸肉类、肉灌肠类不得超过30mg/kg，肉罐头类不得超50mg/kg，西式火腿类不得超过70mg/kg。如果在国家允许的剂量范围内，一般不会影响食用者身体健康。如果添加亚硝酸盐过量或食用过多，就会对食用者身体健康造成危害。由亚硝酸盐引起食物中毒的几率较高，食入0.3至0.5克的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。   因而亚硝酸盐在食品制作添加过程中要严格执行国家限量标准以保证人体的健康4。 1.1.3 亚硝酸盐的国内外研究现状 亚硝酸盐作为一种食品添加剂被广泛应用于肉制品加工中。它

18、的发色、防腐、抗微生物作用至今仍无法用其他的物质所替代，但它对于人体健康的危害是众所周知的5。 为了有效地控制其毒害，目前常采用光度法、示波极谱法、荧光法、离子色谱法、催化动力学法、气相色谱法等测定方法。 格里斯试剂比色法测定食品中亚硝酸盐是测定亚硝酸盐的经典方法，该法设备简单、易于操作，灵敏度较高，是亚硝酸盐测定的第一法。但在测定过程中微波及超声波处理都有可能影响到测定结果。因此，本研究用不同的微波及超声波处理亚硝酸盐提取液，来分析提取液的稳定性，从而为亚硝酸盐的格里斯比色法确定相应的条件要求，然后进行比较研究。1.2 亚硝酸盐的测定方法 目前亚硝酸盐的测定方法主要有示波极谱法、荧光分析法、

19、化学发光法及气相色谱法等。其中国标GB5009.33-85方法盐酸萘乙二胺法及国标GB/T5009.33-96新方法格里斯试剂比色法较为常用6。1.2.1 盐酸萘乙二胺法原理:样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比色定量。操作方法：取样5g,置于50mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和溶液，以70水浴中加热15min，冷却后加5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，定容，混合后过滤，滤液备用。吸取40mL上述滤液，另吸取0、0.20、0.40、0.80、1.00、1.50、2.0、2.50mL亚硝酸钠标

20、准使用液，分别置于50mL比色管中，在标准与样品管中分别加入2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置15min,用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。1.2.2 格里斯试剂比色法原理：样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比色定量。操作方法：取样10g，加70mL水和12mL氢氧化钠，混匀，用氢氧化钠调样品PH=8，定量转移至250mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2-5mL氢氧化钠，混匀。置60水浴锅中10min,取出冷却至室温，加水至刻

21、度。过滤，滤液备用。吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL亚硝酸钠标准使用液分别置于25mL具塞比色管中。与标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL/60%乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min,用1cm比色杯，以0号管调节零点，于波长550nm处测定吸光度，绘制标准曲线。样品测定：吸取10mL上述滤液于25mL带塞比色管中，自“于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液”起依法操作。同时做试剂空白。1.2.3 两种方法的比较虽然两种方法都很适合肉制品中亚硝酸盐的测定，但是格里斯试剂比色法是测定亚硝酸盐的经典方法，该法设备简单、易于

22、操作，灵敏度高，是亚硝酸盐测定的第一法。而且其准确性和稳定性高于盐酸萘乙二胺法7。1.3 微波与超声波的简单介绍1.3.1 微波的简单介绍（1）微波：是指频率为0.3GHz-300GHz的电磁波，是无线电波中一个有限频带的简称，即波长在1毫米-1米之间的电磁波，是分米波、厘米波、毫米波和亚毫米波的统称。微波频率比一般的无线电波频率高，通常也称为“超高频电磁波”。微波作为一种电磁波也具有波粒二象性。微波的基本性质通常呈现为穿透、反射、吸收三个特性。对于玻璃、塑料和瓷器，微波几乎是穿越而不被吸收。对于水和食物等就会吸收微波而使自身发热。而对金属类东西，则会反射微波。（2）微波的萃取原理：利用微波能

23、来提高萃取率的一种最新发展起来的新技术。它的原理是在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中；微波萃取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点。除主要用于环境样品预处理外，还用于生化、食品、工业分析和天然产物提取等领域。在国内，微波萃取技术用于中草药提取这方面的研究报道还比较少。微波萃取的机理可从以下3个方面来分析：微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质到达物料内部的微管束和腺胞系统的过程。由于吸收了微波能，细胞内部的温度将迅

24、速上升，从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力，结果细胞破裂，其内的有效成分自由流出，并在较低的温度下溶解于萃取介质中。通过进一步的过滤和分离，即可获得所需的萃取物。微波所产生的电磁场可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率。例如，以水作溶剂时，在微波场的作用下，水分子由高速转动状态转变为激发态，这是一种高能量的不稳定状态。此时水分子或者汽化以加强萃取组分的驱动力，或者释放出自身多余的能量回到基态，所释放出的能量将传递给其他物质的分子，以加速其热运动，从而缩短萃取组分的分子由固体内部扩散至固液界面的时间，结果使萃取速率提高数倍，并能降低萃取温度，最大限度地保证萃取物的质量

25、。由于微波的频率与分子转动的频率相关连，因此微波能是一种由离子迁移和偶极子转动而引起分子运动的非离子化辐射能，当它作用于分子时，可促进分子的转动运动，若分子具有一定的极性，即可在微波场的作用下产生瞬时极化，并以245亿次/s的速度作极性变换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子间的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的热能，促使细胞破裂，使细胞液溢出并扩散至溶剂中。在微波萃取中，吸收微波能力的差异可使基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被萃取物质从基体或体系中分离，进入到具有较小介电常数、微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。（3）微波性质：微波的基本性质通常呈现为穿透、反射、吸收三个特

26、性。对于玻璃、塑料和瓷器，微波几乎是穿越而不被吸收。对于水和食物等就会吸收微波而使自身发热。而对金属类东西，则会反射微波。从电子学和物理学观点来看，微波这段电磁频谱具有不同于其他波段的如下重要特点：穿透性：微波比其它用于辐射加热的电磁波，如红外线、远外线等波长更长，因此具有更好的穿透性。微波透入介质时，由于微波能与介质发生一定的相互作用，以微波频率2450兆赫兹，使介质的分子每秒产生24亿五千万次的震动，介质的分子间互相产生摩擦，引起的介质温度的升高，使介质材料内部、外部几乎同时加热升温，形成体热源状态，大大缩短了常规加热中的热传导时间，且在条件为介质损耗因数与介质温度呈负相关关系时，物料内外

27、加热均匀一致。选择性加热：物质吸收微波的能力，主要由其介质损耗因数来决定。介质损耗因数大的物质对微波的吸收能力就强，相反，介质损耗因数小的物质吸收微波的能力也弱。由于各物质的损耗因数存在差异，微波加热就表现出选择性加热的特点。物质不同，产生的热效果也不同。水分子属极性分子，介电常数较大，其介质损耗因数也很大，对微波具有强吸收能力。而蛋白质、碳水化合物等的介电常数相对较小，其对微波的吸收能力比水小得多。因此，对于食品来说，含水量的多少对微波加热效果影响很大。热惯性小：微波对介质材料是瞬时加热升温，升温速度快。另一方面，微波的输出功率随时可调，介质温升可无惰性的随之改变，不存在“余热”现象，极有利

28、于自动控制和连续化生产的需要。似光性和似声性：微波波长很短，比地球上的一般物体（如飞机，舰船，汽车建筑物等）尺寸相对要小得多，或在同一量级上。使得微波的特点与几何光学相似，即所谓的似光性。因此使用微波工作，能使电路元件尺寸减小；使系统更加紧凑；可以制成体积小，波束窄方向性很强，增益很高的天线系统，接受来自地面或空间各种物体反射回来的微弱信号，从而确定物体方位和距离，分析目标特征。由于微波波长与物体（实验室中无线设备）的尺寸有相同的量级，使得微波的特点又与声波相似，即所谓的似声性。例如微波波导类似于声学中的传声筒；喇叭天线和缝隙天线类似与声学喇叭，萧与笛；微波谐振腔类似于声学共鸣腔。非电离性：微

29、波的量子能量还不够大，不足与改变物质分子的内部结构或破坏分子之间的键（部分物质除外：如微波可对废弃橡胶进行再生，就是通过微波改变废弃橡胶的分子键）。再有物理学之道，分子原子核在外加电磁场的周期力作用下所呈现的许多共振现象都发生在微波范围，因而微波为探索物质的内部结构和基本特性提供了有效的研究手段。另一方面，利用这一特性，还可以制作许多微波器件。信息性：由于微波频率很高，所以在不大的相对带宽下，其可用的频带很宽，可达数百甚至上千兆赫兹。这是低频无线电波无法比拟的。这意味着微波的信息容量大，所以现代多路通信系统，包括卫星通信系统，几乎无例外都是工作在微波波段。另外，微波信号还可以提供相位信息，极化

30、信息，多普勒频率信息。这在目标检测，遥感目标特征分析等应用中十分重要8。1.3.2 超声波的简单介绍(1)超声波：科学家们将每秒钟振动的次数称为声音的频率，它的单位是赫兹(Hz)。我们人类耳朵能听到的声波频率为20Hz20000Hz。当声波的振动频率小于20Hz或大于 20000Hz时，我们便听不见了。因此，我们把频率高于20000赫兹的声波称为“超声波”。通常用于医学诊断的超声波频率为1兆赫兹30兆赫兹。理论研究表明，在振幅相同的条件下，一个物体振动的能量与振动频率成正比，超声波在介质中传播时，介质质点振动的频率很高，因而能量很大.在中国北方干燥的冬季，如果把超声波通入水罐中，剧烈的振动会使

31、罐中的水破碎成许多小雾滴，再用小风扇把雾滴吹入室内，就可以增加室内空气湿度，这就是超声波加湿器的原理。如咽喉炎、气管炎等疾病，很难利用血流使药物到达患病的部位，利用加湿器的原理，把药液雾化，让病人吸入，能够提高疗效。利用超声波巨大的能量还可以使人体内的结石做剧烈的受迫振动而破碎，从而减缓病痛，达到治愈的目的。超声波在医学方面应用非常广泛，可以对物品进行杀菌消毒。(2)超声波萃取的原理：超声波提取的优越性中草药是基于特殊物理性能的超声。主要是通过机械振动压电换能器所产生的快速波动，以减少目标样本提取部队之间的基质，以达到固-液萃取分离。大众媒介宣传运动，以加速。高于20kHz的高频超声声波的连续

32、介质（例如水）来传播，根据原则惠更斯波动，传播在其波前表面将导致大众媒体（包括重要的药用效果的粒子组成）的运动，大众传播媒介宣传运动已如此巨大的线加速度和动能。计算粒子加速的重力加速度一般可达2000倍。为介质将高能粒子的作用超声医学的效力的组成粒子加速和极大的精力，迅速逃跑，并且自1977年以来，从中药中的水基。空，超声波在液体介质有特殊蔓延的“空化”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到大气压力微空，并继续“爆炸”的功能强大的微冲击波产生的作用的中草药药品，使材料的组成部分中药材已被“轰炸”逃离，使药品基质侵蚀是不断，这不属于工厂的疗效构件已经失散。为了加快浸出的植物提取物的有效成分。吸收

33、的超声波振动（超声波）的样品中一直发挥的作用点，以便能够在更为均匀的样本提取。总之，疗效中药的材料在超声场不仅作为一种媒介，大规模进入自己的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”是一个强有力的外部影响，它们是能够有效地和充分分开9 。（3）超声提取具有以下突出特点：不热，40  -50 的温度提高F超声波提取，高温没有水，没有摧毁一些中草药热不稳定，易水解或氧化的药效学特性的组成部分。超声波可诱导植物细胞壁，以改善疗效的中药。压力提取，安全，操作简单，易于维护。萃取效率高。超声提取20到40分钟可以是最好的提取率，提取时间是唯一一个与水，酒精或少于三分之

34、一的法律。充分开采，开采量为2倍以上的传统方法。据统计，超声在65 - 70 的效率是非常高的。温度65 ç度中草药中的基本成分的植物也没有损坏。加入超声波后（在65度条件下），植物提取物成分的约40分钟。烹饪方法和烹饪时间，往往需要2-3小时，超声提取时间为3倍的时间。具有广谱。广泛适用性，绝大多数的中药材可以的各个组成部分的超声波提取。超声提取的提取溶剂和性质的目标（如极性）没有什么。因此，选择萃取溶剂型，面向范围广泛的提取物。以减少能源消耗。超声波提取由于没有加热或加热温度低，提取时间短，从而大大降低能源消耗。以处理大量的药用原料，成倍或

35、数倍增长，杂质少，易分离的活性成分清理。和低成本的提取工艺，全面的成本效益显着。1.4 本课题研究的目的及意义1.4.1 本课题研究的内容本文利用格里斯试剂比色法测定肉制品中亚硝酸盐的含量，采用不同的微波、超声波对亚硝酸盐提取液进行处理，然后进行比色，确定这些因素对格里斯比色法结果的影响。1.4.2 本课题研究的目的本文通过采用不同条件下的微波、超声波对亚硝酸盐提取液进行处理，然后进行比色，确定这些因素对格里斯比色法结果的影响。1.4.3 本课题研究的意义通过采用不同条件下的微波、超声波处理亚硝酸盐提取液，来分析提取液的稳定性，从而为亚硝酸盐的格里斯比色法确定相应的条件要求。2 材料与方法2.

36、1 主要材料与试剂金锣福火腿肠，万德隆超市购买实验水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。氯化铵缓冲液：称取26.7g氯化铵溶于水加36mL氨水，稀释至1L。必要时用稀盐酸和氢氧化铵调试至PH值9.6-9.7。硫酸锌溶液（0.42mol/L）称取120g硫酸锌，用水溶解，并稀释至1000mL。氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶液，稀释至1L。对氨基苯磺酸溶液：称取10g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。N-1-萘基乙二胺溶液（1g/L）：称取0.1gN-1-萘基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100mL,混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一

37、周内稳定。显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。亚硝基钠标准溶液：准确称取250mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解并移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4避光处保存。此溶液每毫升相当于500ug的亚硝酸钠。亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00mL,置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug亚硝酸钠。2.2 主要仪器与设备SCIENTZ-D超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；XH-MC-1实验室微波合成仪，北京祥鹄科技发展有限公司；721分光光度计，上海菁华科技

38、仪器有限公司；电子恒温不锈钢水浴锅，余姚市上通温控仪表厂；精密PH计，雷磁科技；FA1004型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司。2.3 试验方法2.3.1 原料的处理称取10g火腿肠，研磨碎，加70mL水和12mL氢氧化钠，混匀，用氢氧化钠调样品PH=8，定量转移至250mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2-5mL氢氧化钠，混匀。置60水浴锅中10min,取出冷却至室温，加水至刻度。过滤，滤液备用。2.3.2 亚硝酸钠标准曲线的制作吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL亚硝酸钠标准使用液分别置于25mL具塞比色管中。与标准管中分别加入4.5m

39、L氯化铵缓冲液，加2.5mL/60%乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min,用1cm比色杯，以0号管调节零点，于波长550nm处测定吸光度，绘制标准曲线。入射光波长的选择：入射光波长直接影响到方法的灵敏度和准确度，在入射光波长选择时应遵循“最大吸收原则”。根据这一原则利用不同的波长，用绘制标准曲线用的0号管调零，测定使用液在不同波长下的吸光度。结果表明，在实验室采用分光光度法测定时，生成的显色物质最大吸收波峰在550nm处，与其他文献报道一致。因此，确定测定时的最大吸收波长为550nm。表1入射光波长的选择波长/nm1号2号3号4号5号6号7号50000.090

40、.1020.1070.1710.2220.2951000.1030.1170.1270.20.2580.33252000.1090.1240.1370.2220.2870.37453000.1130.1420.150.2410.3110.39254000.1160.150.1590.260.3230.41155000.1190.1580.1680.2760.3480.42256000.1140.1510.160.2430.320.39857000.1090.1380.1530.2020.260.33258000.0840.1090.120.1570.2020.25559000.0560.077

41、0.0840.1030.1290.17260000.0290.0440.050.0570.0770.105图1 最大吸收波长的确定采用本文的测定方法绘制标准曲线。结果如图2所示y = 0.0132x + 0.0156R2 = 0.968400.050.10.150.20.250.30.350.40.45010203040亚硝酸钠质量/ugA550图2 亚硝酸钠标准曲线2.3.3 样品亚硝酸钠测定的操作吸取10mL上述滤液于25mL带塞比色管中，自“于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液”起依法操作。同时做试剂空白。结果计算： （1） 式中：X-样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg m1-样品质量

42、，g m2-测定用样液中亚硝酸盐的质量，ugV1-样品处理液总体积，mLV2-测定用样液体积，mL102.4 研究方案2.4.1 超声波处理2.4.1.1有机物对亚硝酸盐测定数值的影响（1）油脂对亚硝酸盐测定数值的影响皂化前超声波处理：称量10g样品研磨加水70mL超声波处理15min加12mL氢氧化钠溶液转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤皂化后超声波处理：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液超声波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤（2）蛋白质对亚硝酸盐测定数值的影响蛋白质沉淀前超声波处理

43、：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液超声波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤蛋白质沉淀后超声波处理：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液超声波处理15min60水浴10min定容静置过滤2.4.1.2稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响分别称量7、8、9、10、11、12、13g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液超声波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤2.4.1.3超声波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响（1）超声

44、波处理时间对其影响分别称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液超声波处理0、5、10、15、20、25、30min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤11（2）超声波功率对亚硝酸盐测定数值的影响分别称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液超声波以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的功率处理10min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤2.4.2 微波处理2.4.2.1有机物对亚硝酸盐测定数值的影响（1）油脂对亚硝酸盐测定数值的影响皂化前微波处理：称量10g样品研磨加水70

45、mL微波处理15min加12mL氢氧化钠溶液转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤皂化后微波处理：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液微波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤（2）蛋白质对亚硝酸盐测定数值的影响蛋白质沉淀前微波处理：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液微波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤蛋白质沉淀后微波处理：称量10g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液微波处理1

46、5min60水浴10min定容静置过滤2.4.2.2稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响分别称量7、8、9、10、11、12、13g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液微波处理15min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤2.4.2.3微波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响（1）微波处理时间对其影响分别称量12g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶液微波处理0、2、4、6、8、10、12min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤（2）微波功率对亚硝酸盐测定数值的影响分别称量12g样品研磨加水70mL加12mL氢氧化钠溶

47、液微波以200、250、300、350、400、450、500、550、600w的功率处理10min转移至250mL容量瓶加10mL硫酸锌溶液60水浴10min定容静置过滤2.4.3 两种处理方法的比较 将两种处理方法的最优条件下得到的亚硝酸盐含量进行比较，进而分析两种方法对亚硝酸盐测定数值的影响。3 结果与分析3.1 超声波处理3.1.1 有机物对亚硝酸盐测定数值的影响（1）油脂对亚硝酸盐测定数值的影响分别将样品在皂化前后进行超声波处理15min，得到如下表格：表2 油脂对亚硝酸盐测定数值的影响处理顺序 亚硝酸盐含量（mg/kg）试验一试验二试验三平均值蛋白质沉淀前5.825.565.35.

48、56蛋白质沉淀后11.029.86.669.16由表2可知，皂化后亚硝酸盐的含量明显比皂化前的大，说明油脂对亚硝酸盐的测定数值有一定的影响。（2）蛋白质对亚硝酸盐测定数值的影响分别对样品在蛋白质沉淀前后进行超声波处理15min,得到如下表格：表3 蛋白质对亚硝酸盐测定数值影响处理顺序 亚硝酸盐含量（mg/kg）试验一试验二试验三平均值蛋白质沉淀前11.029.86.669.16蛋白质沉淀后8.599.327.498.59由表3可知，蛋白质沉淀前亚硝酸盐的含量明显比蛋白质沉淀后的大，说明蛋白质对亚硝酸盐的测定数值有一定的影响。 综合可知，皂化后即蛋白质沉淀前亚硝酸盐的含量是最大的。所以在皂化后进

49、行超声波处理能更大程度的使亚硝酸盐浸出，进而增加用格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量的准确性。3.1.2 稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响分别称取7、8、9、10、11、12、13g火腿肠进行处理然后用格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量，得到结果如图所示：图3 稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响由图可知，在研究稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响时可发现当样品重量取10g即稀释倍数为25倍时，亚硝酸盐含量是最大的，所以，稀释倍数为25倍时，有利于提高检测结果的准确性。3.1.3 超声波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响（1）超声波处理时间与亚硝酸盐含量的关系将样品在皂化后分别进行0、5、10、15、20、

50、25、30min的超声波处理，观察其亚硝酸盐含量，得到结果如图：图4超声波处理时间与亚硝酸盐含量的关系由图4可知，在超声波处理10min以内，随着超声波时间的延长，亚硝酸盐的含量增加明显，10min以后，随着超声波处理时间的延长，亚硝酸盐的含量几乎没有变化。因此，短暂的超声波有利于亚硝酸盐的浸出，所以，在样品提取过程中，采用超声波处理10min，有利于提高检测结果的准确性。 表4 不同时间超声波处理与未处理测定值增加量时间/min51015202530测定值增加量（mg/kg）4.918.147.386.997.758.33 由表可知，不同时间超声波处理均比未处理时亚硝酸盐的测定数值量要大（2

51、）超声波处理功率与亚硝酸盐含量的关系将样品在皂化后以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%超声波处理10min，测其亚硝酸盐含量，得到结果如下图：图5 超声波处理功率与亚硝酸盐含量的关系由图5可知，超声波的处理功率在70%以内时，亚硝酸盐的含量逐渐增加，当功率达到70%时，亚硝酸盐的含量达到最大，此后又逐渐减少。因此，70%的功率有利于亚硝酸盐的测定数值，所以，在超声波的功率为70%时，有利于提高检测结果的准确性。 表5不同功率超声波处理的对照试验结果功率（%）1020304050607080测定值增加量（mg/kg）0.560.750.940.822.833.49.8

52、36.62由表可知，不同功率超声波处理均比未处理时亚硝酸盐的测定数值量要大3.2 微波处理3.2.1 有机物对亚硝酸盐测定数值的影响（1）油脂对亚硝酸盐测定数值的影响分别将样品在皂化前后进行微波处理15min，得到如下表格： 表6 油脂对亚硝酸盐测定数值的影响处理顺序 亚硝酸盐含量（mg/kg）试验一试验二试验三平均值蛋白质沉淀前3.13.32.93.1蛋白质沉淀后3.853.863.873.86由表6可知，皂化后亚硝酸盐的含量明显比皂化前的大，说明油脂对亚硝酸盐的测定数值有一定的影响。（2）蛋白质对亚硝酸盐测定数值的影响分别对样品在蛋白质沉淀前后进行微波处理15min,得到如下表格：表7 蛋

53、白质对亚硝酸盐测定数值影响处理顺序 亚硝酸盐含量（mg/kg）试验一试验二试验三平均值蛋白质沉淀前3.853.863.873.86蛋白质沉淀后2.962.962.842.92由表7可知，蛋白质沉淀前亚硝酸盐的含量明显比蛋白质沉淀后的大，说明蛋白质沉淀对亚硝酸盐的测定数值有一定的影响。 综合可知，皂化后即蛋白质沉淀前亚硝酸盐的含量是最大的。所以在皂化后进行微波处理能更大程度的使亚硝酸盐浸出，进而增加用格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量的准确性。3.2.2 稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响分别称取火腿肠7、8、9、10、11、12、13g进行处理，然后用格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量，得到结果如图

54、所示：图6 稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响由图可知，在研究稀释倍数对亚硝酸盐测定数值的影响时可发现当样品重量取12g即稀释倍数为21倍时，亚硝酸盐含量是最大的，所以，稀释倍数为21倍时，有利于提高检测结果的准确性。3.2.3 微波处理条件对亚硝酸盐测定数值的影响（1）微波处理时间与亚硝酸盐含量的关系 将样品在皂化后分别进行0、2、4、6、8、10、12min的微波处理，观察其亚硝酸盐含量，得到结果如图：图7 微波处理时间与亚硝酸盐含量的关系由图7可知，在微波处理10min以内，随着微波时间的延长，亚硝酸盐的含量逐渐增加，10min以后，随着微波处理时间的延长，亚硝酸盐的含量下降直到几乎没有变化。因此，短暂的微波有利于亚硝酸盐的测定数值，所以，在样品提取过程中，采用微波处理10min，有利于提高检测结果的准确性。（2）微波