产低温纤维素酶放线菌的筛选_鉴定及酶学性质初步研究

1、生物技术通报··研究报告BIOTECHNOLOGYBULLETIN2010年第7期产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究李师翁摘要：孔凯冯佳丽李梅台喜生（兰州交通大学化学与生物工程学院，兰州730070）YD5227-2，从青藏高原采集的牦牛粪中，经过CMC平板分离得到一株产低温纤维素酶能力较强的放菌Tibet-经16SrDNA序列比对分析将其初步鉴定为链霉菌属（Streptomycessp），目前尚无链霉菌产低温纤维素酶的研究报道。Tibet-YD5227-2液体摇瓶培养产生低温CMC酶活力高达145U/mL，最适产酶温度25，最适产酶pH值为8.0。酶学性质

2、初步研Tibet-YD5227-2产生的CMC酶反应温度以35左右为适，反应的pH值以8.0左右为适，该菌株所产的纤维素酶在中究显示，+Fe2+、Mg2+对酶反应有促进作用，Hg2+、Cu2+对酶反应有抑制作用。碱性条件具有较强的稳定性；K、关键词：青藏高原低温纤维素酶链霉菌筛选ScreeningandIdentificatiaonofACold-adaptedCellulase-producingActinomyceteandCharacterizationofCellulaseLiShiwengKongKaiFengJialiLiMeiTaiXisheng（SchoolofChemical

3、andBiologicalEngineering，LanzhouJiaotongUniversity，Lanzhou730070）Abstract：Onecold-adaptedcellulase-producingactinomyceteTibet-YD5227-2，wasisolatedfromtheyakdungintheQinghai-TibetplateauThe16SrDNAsequenceanalysisindicatedthatTibet-YD5227-2wascloselysimilarwithStreptomycesspNoworkonStreptomycesspprodu

4、cingcold-adaptedcellulasehadbeenreportedsofarThecold-adaptedcellulaseactivityofshakingflaskcultureofTibet-YD5227-2was145U/mLFurtherinvestigatesshowedthattheoptimaltemperatureandpHforTibet-YD5227-2cellulase-producingwere25andpH9.0Theresultsalsoshowedthattheoptimalconditionsfortheenzymaticreactionwere

5、about35andpH8.0TheenzymeshowedhighactivityandsatisfactorystabilityatpH7.010.0K+，Fe2+，Mg2+weretheactivatorsandHg2+，Cu2+weretheinhaibitiorsoftheenzymeKeywords：Qinghai-TibetplateauCold-adaptedcellulaseStreptomycesspScreening纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的碳源物质，对人类而言，它又是自然界中数量最大的、永不枯竭的可再生资源。纤维素可被纤维素酶降解生成葡萄糖，因此纤维素酶的研究

6、开发和应用是植物质资源再利用的主要途径。普通纤维素酶的最适作用温度一般为4565。低温纤维素酶最适作用，低温纤维素酶能在较低的环境条件下加速生物降解的过程，节约能量与费用。微生物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，温度可低至201迄今为止，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约253个属的几千个菌株，其中主要包括细菌、放线放线菌产生的纤维素酶活力菌和真菌。研究发现，较高，是抗菌素的主要生产菌，同时，放线菌结构简单，为单细胞，便于遗传分析，因此许多研究者正致力于放线菌产纤维素酶的研究3。目前国内外对4，5，产中温和高温纤维素酶的链霉菌的报道较多而对Streptomycessp产低温纤维素酶的研究尚未

7、见报道。我们首次从青藏高原牦牛粪中筛选到一株产收稿日期：2010-02-01基金项目：国家自然科学基金项目（30960063）mail：lishwengyahoocomcn作者简介：李师翁，男，教授，研究方向：重要工业微生物的定向改造与产品制造；E-2010年第7期李师翁等：产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究217低温纤维素酶酶活力高的的放线菌Tibet-YD5227-2，经16SrDNA序列比对分析表明，初步鉴定为链霉菌属（Streptomycessp）。本试验在培养条件优化的基础上，初步研究了该菌所产生的低温纤维素酶的酶学性质。1材料和方法1.1材料来源从青藏高原（32&#

8、176;53.171N91°55.127E）海拔5227m处取牦牛粪样品。1.2培养基分离平板培养基6，复筛培养基6，种子培养基7，发酵培养基7。1.3初筛取样品1g置于装有100mL无菌水的三角瓶中，摇匀，从三角瓶中取1mL转移到另一盛有100mL无菌水的三角瓶，在25振荡培养2h，取0.1mL振荡培养液涂布到以CMC为惟一碳源的培养基平板，倒置恒温4培养7d，注意观察菌的生长情况，挑取单菌落用斜面保存。1.4刚果红染色鉴定法用接种针将斜面单菌落转移到复筛产酶培养基，25恒温培养3d，向培养皿中加入适量1mg/mL的刚果红溶液，染色1h后，用1mol/L的NaCl溶液洗脱。1.5菌

9、株鉴定采用引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，907F5'-AAACTCAAATGAATTGACGGG-3'，517F5'-CCAGCAGCCGCCGGTAAT-3'，进行菌株16SrRNA基因的扩增，50L的扩增体系含有：2单位TaqDNA聚合酶（Promega，Madison，Wis，USA），1×Taqbuff-er，2mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTP，引物各10pmol。PRC扩增30个循环，每个循环包括94预变性2min、58退火1min和72延伸1.5min，最后在72延伸10m

10、in。扩增产物经纯化后送上海生工算进化距离用邻位相连法分析后通过MEGA3.1构建系统发育树，通过Bootstap法对树进行评估分析10。1.6发酵条件试验向在25活化培养4d的斜面培养基中加入5mL无菌水，充分振荡后，从制成的孢子悬液中取1mL接入种子培养基中，25振荡培养2d，再从上述培养基中按2%的接种量向发酵液体培养基中接入种子液，于180r/min，温度25的条件下振荡培养，定时取样测定发酵液中的CMC酶活力，并在上述条件下，对菌株Tibet-YD5227-2发酵条件进行研究。1.7酶活力的测定发酵液于4000r/min离心10min，取上清液过0.22m纤维素膜后作为粗酶液，按DN

11、S11法测定酶活力。在pH值为8.0，35条件下，每分钟水解CMC产生1g葡萄糖的量，定义为1个酶活力单位（U/mL）。以上所测酶活均为扣除发酵液中还原糖量。结果与分析2.1菌株的分离纯化与筛选从取自青藏高原的牦牛粪材料中，在4经稀释涂布平板分离到能在以CMC为唯一碳源的培养基中生长的菌株2株，用刚果红染色，挑选其中透明圈与菌落直径比较大的一株，给该菌命名为Tibet-YD5227-2。培养4d后，Tibet-YD5227-2菌落为白色，圆形边缘不整齐，菌落表面为低凸面，大小为0.5cm；通过插片法观察到有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔。将菌株接种在产酶培养基中，于25、180r/min条件下

12、产酶试验，发酵3d后测定酶活，该菌株产酶活力达106.5U/mL。该菌株在液体发酵培养基中产酶量较高，因此有必要对该菌株进行产酶条件和酶学性质的进一步研究。2.2菌株的分子生物学鉴定菌株Tibet-YD5227-2的16SrDNA基因序列提交GenBank数据库，获得Tibet-YD5227-2登录号为GQ169308（已公布），与GenBank数据库中已有的16SrDNA基因序列进行相似性比较分析，Tibet-YD5227-2与图1中链霉菌属（Streptomycessp）相似性均达99%。该株放线菌的系统发育树如图1。218生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第

13、7期图1Tibet-YD5227-2的16SrDNA序列为基础的系统发育树2.3的种子液分别以2%的接种量接入初始pH值分别7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的发酵培养基中，为6.0，在25下振荡培养4d，测定其酶活力。结果如图3所示，该菌在碱性条件下能维持较高的酶活水平，当培养基初始pH值为9.0时酶活达到最高。温度对菌株产酶的影响将菌株Tibet-YD5227-2的种子液以2%的接种量接入液体摇瓶15、20、25、30、35、40和45下分别在10、培养基中，培养，培养4d后取样按DNS法测定酶活。结果如YD5227-2在1035条件下，图2所示，Tibet-菌25时菌株产酶活力达

14、到最高，丝体生长并且产酶，图2温度对菌株产酶的影响图3初始pH对菌株产酶的影响2010年第7期李师翁等：产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究219时间对菌体生长及产酶的影响将Tibet-YD5227-2于25，pH维持在9.0时，振荡培养，并定时取样测定干重和酶活力。结果如图4所示，该菌在培养96h后，干重和酶活力均达到最高，其中酶活力为145U/mL。随着时间的进一步增加，菌体干重和酶活呈下降趋势。图4时间对菌体生长及产酶的影响2.4酶学性质的初步研究酶反应的最适温度将Tibet-YD5227-2的CMC酶液分别在5、10、15、20、25、30、35、40、45和50条件下反

15、应30min后测定酶活。由图5可知，Tibet-YD5227-2所产CMC酶最适反应温度35，在5、10下仍有一定的酶活，属于低温纤维素酶；目前尚无对产低温纤维素酶的Streptomycessp的研究报道，本研究首次筛选到产低温纤维素酶高活力的链霉菌Tibet-YD5227-2。图5温度对CMC酶活力的影响酶反应的温度稳定性将Tibet-YD5227-2的CMC酶液分别在4、15、25、35、45和55条件下分别保温0.5、1、1.5、2和2.5h后，在35测定剩余酶活力。由图6可知，该酶在4时稳定性最好，随着温度升高，稳定性下降，45放置2.5h之后，残余酶活维持在20%左右，55放置2h，

16、酶活完全丧失。图6温度对CMC酶稳定性的影响酶反应的最适pH值将来源于Tibet-YD5227-2的CMC酶液分别置于不同的pH条件下测定CMC酶活力。由图7可知，Tibet-YD5227-2所产CMC酶反应最适pH值为8.0，且在pH值为7.010.0左右也有较高的酶活性，说明Tibet-YD5227-2所产生的酶制剂在棉织品生物整理剂以及洗涤工业中将具有良好的应用前景。图7pH值对菌株CMC酶活力的影响酶反应的pH稳定性将于源于Tibet-YD5227-2的CMC酶液分别置于不同的pH环境中，于35下保温60min，按常规方法测定酶活力。如图8所示，金属离子对酶活性的影响在酶反应体系中加入

17、不同的金属离子（0.01mol/L），测定所产的CMC酶活力，结果如表1所示，K+、Fe2+、Mg2+对酶反应有促进作用，Hg2+、Cu2+对酶反应有抑制作用。220生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第7期图8不同pH值条件下CMC酶活的稳定性表1金属离子对酶活性的影响金属离子对照Hg2+K+Fe2+Mg2+Mn2+Zn2+Cu2+Ca2+相对酶活力（%）10030142132126959665983结论低温纤维素酶在低温条件下可以高效发挥作用，为工业生产降低成本，具有重要的应用和研究价值。在过去半个多世纪里，人们主要从寒带和冰川等不同的环境的陆地开发和获得低温纤

18、维素酶12，其中对细菌产低温纤维素酶的报道较多13，14，对产低温纤维素酶的链霉菌研究尚未见报道。本研究首次从青藏高原牦牛粪中分离得到一株产低温纤维素酶酶活力高的链霉菌，酶学性质初步研究显示，该酶最适反应温度为35，最适反应pH值为8.0，在碱性条件下具有较高的酶活和稳定性。近10年来，随着中性和碱性纤维素酶在清洗、纺织等方面的广泛应用，该菌株所产的纤维素酶也将在常温催化和碱性应用方面显出良好的应用前景和经济价值。参考文献1AkilaG，ChandraTSAnovelcold-tolerantclostridiumstrainPX-YL1isolatedfromapsychrophilicca

19、ttlemanuredigesterthatsecretesthermolabilexylanaseandcelluloseFEMSMicrobiolLett，2003，219：63-672高伦江，董全，唐春红纤维素酶的研究进展及前景展望江苏食品与发酵，2007（4）：5-83吴斌，胡肆珍产纤维素酶放线菌的研究进展中国酿造，2008（1）：5-84宋波，羊键一株降解纤维素放线菌的筛选及其产酶条件的研究微生物学杂志，2005，5（25）：36-395vanSolingenP，MeijerD，vanderKleijWA，etalCloningandex-pressionofanendocellulasegenefromanovelStreptomyceteisolatedfromanEastAfricansodalakeExtremophiles，2001，5（5）：33-3416顿宝庆，吴薇，王旭静，等一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定中国农业科