大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建

1、    大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建        【摘要】目的研究同一细胞内不同形态线粒体的数量、大小和超微结构。方法用三维重建和体视学测量的方法，研究成年大鼠肝细胞线粒体的形态类型。结果3。体现学分析显示，各型线粒体的体积密度有差异(P0.05或P0.01)，型线粒体体积密度最大，然后是、和型，型线粒体体积密度最小。、和型线粒体嵴膜密度均高于或型(P0.05)。结论肝细胞内不同形态的线粒体都占有一定的比例，他们不仅体积差异很大，其超微结构亦有不同。【关键词】肝细胞线粒体

2、三维重建体积密度膜密度 THREE-DIMENSIONAL RECONSTRUCTION OF MITOCHONDRIA IN RAT HEPATOCYTEMu Changzheng, Xi Huanjiu*, Bao Cuifen, Liu Xia,Erik IIS Christensen*, Cui Shiying(Department of Histology and Embryology,* Department of Anatomy,Jinzhou Medical College,Jinzhou;*Department of Cell Biology, Institute of An

3、atomy,Aarhus   University, Denmark)【Abstract】Objective To examine the number,size and ultrastructure of the different forms of mitochondria in a cell.Methods Morphological types of the mitochondria in rat hepatocyte were studied by threedimensional reconstruction and stereological analyses.Resu

4、lts The mitochondria may be classified into five basic types according to their morphological characteristic.The numbers(%)of type (sphere, ellipses and disc),type (rods),type(irregulars),type(branches)and type(budding)were 21.4%,32.4%,23.8%,19.6% and 2.8%,respectively.And their average volume were

5、0.11m3,0.21m3,0.32m3,0.51m3 and 0.64m3, respectively. Stereological analyses showed that there were significant difference in volume,density and crista membrane density among five types of mitochondria(P0.05 or P0.01).The volume density of mitochondria type was the highest,that of type the lowest an

6、d that of type ,type and type the medium.Mitochondrial cristamembrane density of type ,type and type was higher than both that of type and type .Conclusion Each type of mitochondria kept a suitable proportion in normal rat liver cell.There were significant difference not only in volume among differe

7、nt forms of mitochondria,but also in ultrastructure.【Key words】 Hepatocyte; Mitochondria; Three-dimensional reconstruction; Volume density; Membrane density线粒体在生长过程中以及在不同的生理或病理状态下，其形态会发生很大改变13。自60年代以来，各种细胞线粒体微细结构的研究报道甚多，但对同一细胞内线粒体形态结构和功能差异的研究较少。我们利用三维重建技术研究大鼠肝细胞线粒体的立体形态，并对其体积密度和嵴膜密度进行体视学测量，为研究线粒体的结构

8、与功能变化提供了形态学依据。材料和方法雄性Wistar大鼠5只，体重200320g，Inactin(Bjk-Golden,Knostanz,FRG)腹腔注射麻醉(150mg/kg)。以140mmHg的压力经腹主动脉灌注1%戊二醛(溶于0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液中，pH7.2)，20min后，摘除肝，切取肝组织块，2.5%戊二醛继续固定1h。再以1%锇酸(溶于0.1mol/L巴比妥-醛酸缓冲液中，pH7.2)后固定1h，逐级酒精脱水，环氧树脂Epon 812包埋。每只大鼠取3个肝组织块，每块组织在LKB Ultrotome型超薄切片机上切1组连续切片，分别收集在贴有Formar膜的单孔铜网

9、上。枸橼酸铅染色2min，醋酸铀染色10min。JEOL JEM-1200EX电子显微镜观察。电镜下，在每组连续切片中，随机选取3个肝细胞进行连续观察。在放大10 000倍的条件下，对选定的肝细胞以蒙太奇法进行全细胞摄片，洗印时放大3倍，通过照片组合制成完整的肝细胞照片。组合后的肝细胞照片数与其相应的连续切片相等，即每个肝细胞制成1组与其连续切片相应的照片。校正仪器放大倍数后，测得照片实际放大倍数为28 92029 600倍。通过测量球形小泡(内吞泡、溶酶体等)的直径和球形小泡的连续切片数，计算切片厚度(切片厚度=球形小泡直径/球形小泡连续切片数)4。各组连续切片的厚度为38.551.0nm。

10、在每个肝细胞的1组连续切片照片中，取其中位数照片上的所有线粒体为观察对象(例如：1个细胞连续切片55张，第28张即为中位数切片。其上如有线粒体105个，该105个线粒体则全部为观察对象)。通过连续切片观察分析每个线粒体的立体形态，按随机原则从中选取10个线粒体用于三维重建。重建时，根据每个肝细胞切片厚度的不同，分别选用不同厚度的胶板(胶板厚度=平均切片厚度×照片实际放大倍数)，以连续切片照片中的线粒体为模板，按其原位重建三维模型。本研究共观察线粒体总数29 010个(来源于5只大鼠)，重建线粒体模型450个。应用点计数法，通过方格测试系统测量线粒体体积密度，嵴膜密度，以及其他细胞器的

11、体积密度5。利用模型排水法测量线粒体模型的体积，再除以其放大倍数的3次幂，得出实际线粒体体积6。结果1. 线粒体的形态类型连续切片的观察分析和三维重建术显示，肝细胞线粒体形态多样，按其形态特征可划分为5个基本类型，型为球形、椭球形和盘状；型为杆状；型为不规则形；型为分支形；型为出芽形(15)。在每个肝细胞中，各型线粒体都占有一定的比例，其中以型线粒体最多，其次为型、型和型，型线粒体数量最少(表1)。2. 线粒体的体积、体积密度及嵴膜密度通过线粒体模型测量的线粒体体积总均数为0.29m3。各型线粒体体积差异显著(P0.01)。线粒体体积与形态有很大关系，一般讲，形态越复杂者体积越大(表1)。体视

12、学分析显示，成年大鼠肝细胞线粒体体积密度明显高于其他膜相结构的体积密度(P0.01)。线粒体体积占肝细胞胞质体积的18.6%(表2，6)。分析还显示，各型线粒体的体积密度有所不同，除型与型无差异外，其余两两比较均有差异或显著差异(P0.05或P0.01)。其中型线粒体体积密度最大，然后是型、型和型，型的体积密度最小(表1)。表1各型线粒体形态计量参数Table 1 Morphometric parametor of different types of mitochondria类型 type数量与百分数(%)number and percentage平均体积(m3)average volume

13、<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>±s体积密度(m0)volume density<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>±s<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158&quo

14、t; 13 16>×100嵴膜密度(m1)crista membrane density<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>±s<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>6208(21.4)0.11±0.0283.31±0.064.88±0.89*933

15、9(32.4)0.21±0.0485.85±0.755.02±0.97*6905(23.8)0.32±0.0564.76±1.093.69±0.74 *5686(19.6)0.51±0.0173.91±0.273.85±0.68 *812(2.8)0.64±0.0540.72±0.165.14±1.02*     各型线粒体平均体积每两者相比均有显著差异P0.01 参照系为胞质，除与两者比较外，其他两者相比，P0.05或P0.01 参照

16、系为线粒体，*表示与*比较有差异P0.05Significant difference of average volume(P0.01)was detected among all the types. Reference system is cytoplasm.Significant difference (P0.05 or P0.01) was detected among all the types.except and . Reference system is mitochondria.*represent significant difference at P0.05,as com

17、pared to *. 表2大鼠肝细胞胞质体积密度Table 2 Volume density of the cytoplasm in rat liver cell结构成分 structure composition<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>±s<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>&

18、#215;100结构成分structure composition<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>±s<"109 (145 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309160856158" 13 16>×100线粒体mitochondria18.6±2.4溶酶体lysosome2.2±0.5滑面内质网smooth endo

19、plasmic reticulum13.7±3.8糖原glycogen13.7±4.3粗面内质网rough endoplasmic reticulum7.7±1.7脂滴fat drop1.5±0.9高尔基复合体Golgi complex2.1±0.7基质stroma40.2±6.9     参数系为胞质，n=5 Reference is cytoplasm,n=5线粒体嵴膜密度分析表明，各型线粒体间有所不同，其中、型之间无显著性差异，、型之间亦无显著性差异，而、型与、型比较，每两两之间均有差异(

20、P0.05)，型线粒体嵴膜密度最大，型线粒体嵴膜密度最小，其余各型居此两者之间(表1)。1型(球形、椭球形和盘状)线粒体三维重建模型2型(杆状)线粒体三维重建模型3型(不规则形)线粒体三维重建模型4型(分支形)线粒体三维重建模型5型(出芽形)线粒体三维重建模型Fig.1 Three-dimensional models of mitochondria type (sphere,ellipese and disc).Fig.2 Three-dimensional models of mitochondria type (rods).Fig.3 Three-dimensional models o

21、f mitochondria type (irregulars).Fig.4 Three-dimensional models of mitochondria type (branches).Fig.5 Three-dimensional models of mitochondria type (budding).6正常大鼠肝细胞N.细胞核m.线粒体标尺示1mFig.6 Normal rat hepatocyte.N:nucleus,m:mitochondria Bar=1m 讨论早在60年代即证实肝细胞线粒体具有多样性和可变性。近年的研究表明：小鼠胚着床前线粒体由球形向椭球形和长杆状转变1；

22、发育不同时期的肾小管和肠上皮细胞内线粒体变化也很大，即由简单的球形、椭球形向复杂的分支形转化5。一般认为，线粒体常以出芽方式生长，以分裂方式增殖，这都会导致形态变化。本研究通过连续切片的观察及重组线粒体三维模型，进一步证实了肝细胞线粒体形态的多样性。除球形和椭球形外，还有相当数量的不规则形、分支形和出芽形，这表明正常肝细胞内同时存在着发育不同阶段的线粒体。我们根据线粒体的形态特征，并参考前人的研究成果1，68，将线粒体划分5种类型。传统观点认为，哺乳类动物每个肝细胞内大约有1 0002 000个线粒体，这种估计是基于二维像分析的结果，由于忽略了线粒体断面之间的联系，常错把一个不规则形或分支形的

23、大线粒体当成几个线粒体来处理，因此，其数据常常有偏差。我们通过连续切片观察，认为肝细胞线粒体形态多样，其数量仍需进一步准确测定。已有研究表明，正常肝细胞内各型线粒体均占有一定的比例，当肝细胞处于不同的生理或病理状态时，这种比例可能会发生改变2，3，例如，随着年龄的增长，线粒体数量减少，不规则形和分支形线粒体比例增大8。某些病理情况下，线粒体不仅数量减少，嵴膜异常和膨胀也引起外形的改变，从而使各型线粒体比例发生变化3。肝细胞内不规则形和分支形线粒体占有相当的数量，用直径表示线粒体的大小是不准确的。本研究利用模型排水法测量线粒体体积，尽管其结果与实际体积尚有差距，但对于比较各型线粒体的大小来说还是

24、很有意义的。体积密度尽管不能表示线粒体的实际大小，却能在一定程度上反映细胞内线粒体的含量。如肝细胞内型线粒体平均体积最大，但因其数量甚小，因此其体积密度最小，型线粒体平均体积虽小，但其数量最多，所以体积密度最大。一般认为，线粒体嵴的多少能反映其氧化磷酸化程度，进而反映线粒体的功能状态3。本研究显示，肝细胞内、和型线粒体嵴膜密度都明显高于或型，这表明前三者的功能状态明显比后两者活跃。型线粒体数量最多，体积密度最大，功能很活跃，我们推测它们可能是肝细胞最主要的能量提供者。从体积大小、功能状态及线粒体发育特点上看，型线粒体可能是较为幼稚的线粒体，和型线粒体可能是成熟的或接近衰老的线粒体，型线粒体则处

25、于出芽生长阶段。总之，肝细胞内各型线粒体都占有一定的比例，由于处于不同的生长阶段，因此不仅体积不同，其功能状态亦有所差异。作者单位：穆长征席焕久*?包翠芬刘霞Erik IIS Christensen* *?崔士英锦州医学院组织学胚胎学教研室，?解剖学教研室，锦州121001；奥尔胡斯大学解剖学系细胞生物学研究室，丹麦参考文献1韩贻仁，赵晖.小鼠胚着床前线粒体的分布和超微结构变化.解剖学报，1998，29(3)：3032Beretiter-Hahn J.Dynamics of mitochondria in living cell:shape changes dislocation,fusion,and fission of mitochondria.Microse Rec Tech,1994,27(3):1983Sherratt HS.Mitochondria:s