实验十三 细菌的生理生化反应 - 成都大学

1、实验十三 细菌的生理生化反应甲基红试验、糖发酵试验、淀粉水解试验，H2S试验，一、实验目的1了解细菌鉴定中常用的主要生理生化反应试验法及其原理。2比较4种菌的大分子水解实验结果。3比较4种菌的甲基红反应结果。4学习如何使用杜氏小管进行糖发酵试验，并比较3种菌的糖发酵试验结果。二、实验原理各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢

2、、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH52为黄色，pH68为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证。三、实验器材大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌的斜面菌种。荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureuse），2葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)；淀粉培养

3、基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培养基。40NaOH溶液、甲基红试剂、1.6溴甲酚紫指示剂。3超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、试管、移液管，杜氏小管。四、实验方法（一）甲基红试验：1试管标记  取5支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌，枯草芽孢杆菌和空白对照。2接种培养  以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照不接菌。置37恒温箱中，培养2448h。3观察记录取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入35mL以上对应管中的培养液，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养

4、液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应，若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“+”或“一”表示。（二）糖发酵试验：1试管标记2接种培养3观察记录  与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“-”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表示。（三）淀粉水解试验 （一）淀粉水解试验某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再变

5、蓝色。试验时将装有淀粉培养基的三角瓶置于洗水浴中融化，然后取出冷却至约50左右，即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。每个同学用接种环取少量菌涂在平板上，每个菌种涂片 0.30.5cm大小的圆（见图14-1）、其中一种应以枯草杆菌（Bacillus subtilis）作为对照菌。图141 淀粉水解试验接种示意图1. 枯草芽孢杆菌2. 试验菌13. 大肠杆菌4. 试验菌2将培养皿倒置于37恒温箱中培养24h，观察时打开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。（四）硫化氢的产生试验许多细菌能从培

6、养基中的含硫有机化合物产生硫化氢。硫化氢遇铅盐（或铁盐）则形成黑色硫化铅（或黑色硫化铁）。试验常用胱氨酸或半胱氨酸作为含硫有机物。1方法接种与观察：用新鲜斜面培养物（菌种）接种到硫化氢试验培养基中。接种后，用无菌镊子夹取醋酸铅滤纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接进培养基表面，不接触液面，适温培养。于接种后3、7、14天观察，纸条变黑者为阳性，不变者为阴性。2. 注意事项a. 此方法比较敏感，本培养基不适用于肠杆菌科。b. 纸条高度应放置适当，离液面太远影响灵敏度，太近容易被溅湿。同时移动试管时也要平稳。c. 除空白对照外，应放阴性对照。（五）石蕊牛奶试验牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪蛋

7、白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。中性时石蕊呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况：1. 酸凝固作用细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。2. 凝乳酸凝固作用某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生一些碱性物质，使石蕊变蓝。3. 胨化作用酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原脱色。接种大

8、肠杆菌或荧光假单胞菌于石蕊牛乳培养基中，置于37恒温箱内培养7d。另外保留1支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照。（六）油脂水解试验某些细菌可以产生脂肪酶（胞外酶），能分解培养基中的脂肪成为甘油及脂肪酸。试验时，将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振荡使油脂均匀分布，再倾入培养皿中，待凝固后，做成平板。每个同学划线接种于同一平板的两边，其中一种是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为对照菌（图9-2）。置于37恒温箱内培养24h，取出后观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，即说明脂肪被水解，此反应为正反应。图14-2 油脂水解试验接种示意图1. 金黄色葡

9、萄球菌2. 大肠杆菌3. 试验菌14. 试验菌2五、实验报告细菌生理生化反应试验测定结果：六、关键步骤与注意事项1甲基红试验中，不要过多滴加甲基红指示剂，以免出现假阳性反应。2在糖发酵试验的培养管中装入倒置杜氏小管时，注意防止小管内有残留气泡。灭菌时适当延长煮沸时间可除去管内气泡。七、思考题 1细菌生理生化反应试验中为什么要设有空白对照?2哪些生理生化试验可用于区别大肠杆菌和产生肠杆菌?结果如何?3甲基红试验和伏一普试验的最终产物如何?为什么会出现不同的最终产物?4现分离到一株肠道细菌，试结合本实验学到的知识设计一个试验方案进行鉴别。5分述淀粉水解试验油脂水解试验和石蕊牛奶试验的基本生化原理。

10、附培养基： 1淀粉水解培养基蛋白胨 10g氯化钠 5g可溶性淀粉 2g，牛肉膏 3g，琼脂 1520g，水 1000mL，pH 7.47.8，121高压蒸汽灭菌30min。2硫化氢试验培养基蛋白胨 10g，胱氨酸 0.1g，Na2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.07.4分装试管。每管液层高度45cm。0.6kg蒸汽灭菌2030min。另外将普通滤纸剪成0.51cm宽的纸条。长度根据试管与培养基高度而定。用5-10的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿内灭菌备用。3石蕊牛奶培养基（1）脱脂牛奶的制备新鲜牛奶用离心机分离，除去上层奶油，取下层脱脂牛奶。若无新鲜牛奶可用脱脂奶粉代替，每1000mL溶解100g脱脂奶粉，或将鲜奶煮沸，在冷凉处静（2）石蕊液的的制备将石蕊浸色即在蒸馏水中过夜或更长时间，使石蕊变软而易于溶解，溶解后过滤，即可用作配制石蕊牛奶。石蕊2.9g，蒸馏水100mL（3）石蕊牛奶的配制：2.5石蕊水溶液4mL，脂肪牛奶100mL，混合后的颜色为丁香花紫色为适度，分装试管，牛奶高度约4cm。间歇灭菌或以0.6kg蒸气灭菌20-30min。注意事项：最好用新鲜牛奶，否则需调pH，但调过pH的牛奶色调不正。4. 油脂