血浆DNA定量检测的标准化操作流程资料

1、血浆DNA定量检测的标准化操作流程南京医科大学第一附属医院临床检验中心2007年12月第1版1. 血液样本的采集：(1) EDTA-K2抗凝真空采血管（无分离胶）采集外周静脉血23 ml，充分颠倒混匀，记录采集时间。或者 (2) EDTA-K2抗凝真空采血管（有分离胶）采集外周静脉血23 ml，充分颠倒混匀，记录采集时间。2. 血液样本的处理：分离血浆(1) 步骤1-(1)的抗凝血经3 000 rpm低速离心10 min后，吸取上层血浆，再经16 000 g高速离心10 min后，吸取上层血浆200l，加入到“血浆DNA定量样品管”中（含50 000 copies质粒DNA内参照），余血浆样本

2、-20及以下冻存。无法立即处理，见步骤3。(2) 步骤1-(2)的抗凝血经3 000 rpm低速离心10 min后，吸取上层血浆200l，加入到“血浆DNA定量样品管”中（含50 000 copies质粒DNA内参照），余血浆样本-20及以下冻存。(3) 血液样本采集后若无法立即处理，需详细记录采集时间，4或室温保存（48h内必须分离血浆）；密闭阴凉常温下运输（48h内必须完成运输并分离血浆）。3. 血浆样本的处理：核酸的提取和纯化(1) 采用磁珠法提取步骤2-(1)和2-(2)的200l血浆样本中的微量DNA。具体操作如下： 在“血浆DNA定量样品管”中加入200 µl 裂解液1和

3、4 µl蛋白酶，与待测血浆充分混匀后放55 水浴 15 min； 将离心管取出后每管加入600 µl 磁珠/结合液的混合液，振荡混匀，室温放置10 min，中间颠倒混匀一次； 将离心管侧靠在磁珠分离操作台的磁体上，放置 4 min，吸弃液体，注意不要碰或吸走红色沉淀，将离心管拿离磁体； 在离心管内加入200 µl 洗液3，将红色沉淀振荡，充分混匀，然后将离心管侧靠在磁体上，放置1 min，吸弃液体，将离心管拿离磁体； 在离心管内加入100 µl 洗液4，将红色沉淀振荡，充分混匀后，将离心管侧靠在磁体上，放置1 min，吸弃液体，将离心管拿离磁体； 离心管

4、放在55 烤箱中干燥10 min； 在干燥后的离心管内加入40 µl 洗脱液5，充分溶解红色沉淀，在55 烤箱中保温10 min，离心管侧靠在磁体上，放置1 min，将液体取出放入干净的无菌离心管内，即为DNA提取液。(2) 血液样本分离后得到的血浆若无法立即处理，需详细记录分离时间，-20及以下冻存，冰冻运输（48h内必须完成运输并进行核酸提取）。4. 双重荧光定量PCR：(1) 双重荧光定量PCR反应体系，包括：去离子水、缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物1、引物2、引物3、探针1、探针2、热启动DNA聚合酶和DNA模板。反应条件为：95预变性5min；94 30s，55 30

5、s，72 40s 共45个循环，每次循环结束前采集一次荧光信号。(2) 提取的核酸样本若无法立即检测，需详细记录提取时间，-70及以下冻存（48 h内必须进行检测）。5. 数据分析和计算：根据扩增曲线的情况，设定基线和阈值，获得各样本的荧光信号数据和Ct值。采用LinRegPCR软件，根据荧光信号数据，获得各样本扩增效率，并分别计算内参照物和目的基因的平均扩增效率Ep和Eb。根据公式 计算各样本的血浆DNA浓度（copies/ml），其中，Cp=250 000 copies/ml。再根据1copy人基因组DNA为3.3pg，将所得的结果（copies/ml）换算为血浆DNA浓度（ng/ml）。

6、6. 室内质量控制：(1) 按照步骤1-(1)收集数名健康体检者抗凝静脉血，经3 000 rpm低速离心10 min后，吸取上层血浆，再经16 000 g高速离心10 min，吸取上层血浆，获得混合血浆约2 ml，作为质控品血浆。(2) 取200l质控品血浆，加入到“血浆DNA定量样品管”中（含50 000 copies质粒DNA内参照干粉）。余步骤参照步骤3、4、5。(3) 重复步骤6-(2)共20次，计算质控品血浆DNA浓度的平均值(M)和标准差(SD)，以M±2SD作为血浆DNA定量检测的质量控制范围。(4) 每次临床样本的检测，从步骤3开始，质控品血浆都伴随进行。当质控品血浆DNA浓度在M±2SD范围内，此次定量结果可信；当质控品血浆DNA浓度在M±2SD范围外，此次定量结果不可信，重复步骤3、4、5。(5) 每10次在M±