漆酶处理不同树种木材自由基变化的比较研究

1、漆酶处理不同树种木材自由基变化的比较研究*段新芳1)* 曹远林2)* 曹永建1) 周冠武1) 陈永圣2)朱家琪1)赵保路2) （1 中国林科院木材工业研究所 北京 100091; 2 中国科学院生物物理研究所 北京 100101）摘 要：漆酶处理木材可以产生自由基，为探讨漆酶处理产生自由基与木材树种的关系，选择0C、反应2小时的条件下对三种木材进行漆酶处理，测定漆酶处理后木粉悬浮液中活性氧类（ROS）自由基的变化。结果表明：漆酶处理对木粉悬浮液中ROS自由基的浓度有极显著影响；漆酶处理木材ROS自由基浓度与木材树种密切相关，思茅松心、边材的漆酶处理效果优于枫香木材。关键词：漆酶 思茅松 枫香

2、活性氧（ROS）自由基 木材Comparison of Intensities of ROS Free Radicals among Different Laccase-treated Woods*DUAN Xin-Fang1)* CAO Yuan-Lin2)* CAO Yong-Jian1) ZHOU Guan-Wu1) Chen Yong-Sheng2) ZHU Jia-Qi1) ZHAO Bao-Lu2) （1 Division of Wood Protection, Research Institute of Wood Industry, Chinese Academy of Fore

3、stry, Beijing 100091; 2 Center for Brain and Cognitive Sciences, Institute of Biophysics, The Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101）Abstract: In order to investigate the changes of free radicals in the suspension liquid of woodr treated by laccase, woodflour of Pinus kesiya var. langbianensis

4、sapwood ,heartwood and Liquidambar formosana were selected to detect the changes of free radicals after laccase treatment. The laccase treatment parameters were as follows: pH 3.47 and 6.50, 2 hours of laccase incubation, the temperature of 32oC and enzyme dosage 19 U/g dry woodflour. The results sh

5、owed that there was a significant difference of the intensities of the reactive oxygen species (ROS) free radicals in the aqueous suspension of wood between control and samples treated by laccase. The intensities of ROS free radicals among different woods treated by laccase was marked difference. Th

6、e intensities of ROS free radicals of Pinus kesiya var. langbianensis sapwood or heartwood treated by laccase were higher than that of Liquidambar formosana.Keywords: Laccase, Pinus kesiya var. langbianensis，Liquidambar formosana，Reactive oxygen species (ROS) free radicals, Wood1。人们已经对漆酶在木素合成和降解过程中的

7、作用进行了大量的研究，发现漆酶和过氧化物酶通过自由基反应促使木素合成和降解。漆酶催化氧化木纤维表层的木素使木纤维之间胶合在工业生产中很有实用价值2。漆酶作用于木材产生的胶合作用与纤维中形成的相对稳定的自由基有关。以前对木材中形成资助项目：国家科技部基础研究重大项目前期研究（2001CCA00200）、国家自然科学基金项目（30471352）*通讯作者: 段新芳，博士，研究员。主要从事木材功能性改良、木材生物技术，古建筑木结构保护研究。电话E-mail：xfduan；地址:100091，中国林科院24号信箱*曹远林：中国科学院生物物理研究所，博士，副研究员。电话：01

8、0-64865690 E-mail : caoyl的自由基的研究主要集中于已经分离的木素和木素模型化合物，对漆酶催化氧化实木产生的自由基研究较少。过氧化物酶和漆酶与溶解的磨木木素反应都能产生酚氧自由基3。虽然Kleinert4在1967年报道在过氧化物酶氧化的磨木木素中直接观测到了稳定的自由基，但没给出详细的电子自旋共振谱的超精细分裂。Felby等2在1997年用漆酶催化氧化欧洲水青冈（Fagus sylvatica）纤维后，发现了高浓度的半衰期超过两个星期的稳定的自由基。漆酶催化木材进行的氧化反应也可能产生了活性氧类自由基，即超氧阴离子自由基和羟基自由基。在木素的真菌降解过程中已经检测出了活

9、性氧自由基6-8。虽然Milstein等9在1994年应用固相酶作用于工业木素产生了反应中间产物超氧阴离子自由基，但仅仅是基于间接的细胞色素C分析的方法。Felby等5在1997年重复了Milstein等用细胞色素C检测超氧阴离子自由基的试验，认为细胞色素C可与除超氧阴离子自由基以外的很多物质反应，故用细胞色素C分析的方法检测超氧阴离子自由基特异性差，应谨慎使用。本研究采用漆酶处理不同树种木材，利用电子自旋共振（Electron Spin Resonance,ESR）波谱仪测定漆酶处理前后木粉悬浮液中自由基的变化，探讨漆酶处理产生自由基与木材树种的关系。1 材料和方法1.1 材料木材试样为枫香

10、（Liquidambar formosana）、思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）边材和心材木粉（60-80目），漆酶为中国科学院微生物研究所制备（酶活19U-苯基硝酮(PBN,N-tert-butyl-phenylnitrone)为Sigma公司产品，乙酸乙酯等。1.2 方法选用枫香、思茅松边材和心材3种木材试样，2种处理（仅加去离子水的对照和漆酶处理）进行漆酶处理试验。各种试样的具体处理步骤如下：对照，取各种木粉45mg放入不同离心管中，加入去离子水450l，再加入自旋捕捉剂PBN溶液50l、0.04M（终浓度为4mM）。漆酶处理，取各种木材木粉45m

11、g放入不同离心管中，各加入漆酶液450l，分别加入两种pH值(3.47、6.50)的缓冲液450l和自旋捕捉剂PBN溶液50l、0.04M（终浓度为2.2mM）。将以上添加了各种处理试剂的离心管放入水浴锅中在温度为320C下反应2个小时后，取出迅速放入碎冰中，再分别加入300L乙酸乙酯到各离心管中用于萃取，振动100120秒，使之充分混匀，然后离心4分钟（9×103转/分），使离心管中的悬浮液分层，用微量进样器吸取上层清液，进行ESR测定。电子自旋共振波谱仪为德国产Bruker ER200D-SRC,X-band。测试条件为：中心磁场，3385G；扫描宽度，400G；调制幅度，3.2

12、G；增益，4×105；微波功率，20mW。每个试样进行3个重复的测定，以3个重复的平均值作为该样品的平均值。自由基的相对浓度计算方法是测量ESR图谱中的峰高，以其平均值作为该样品的自由基浓度。1.3 数据分析试验数据以(±s)表示，将3次重复的实验结果进行ANOVA统计分析，P<0.05为差异显著。2 结果和分析2.1 未加漆酶处理和加漆酶处理木材的ESR图谱从图1可见，未处理枫香木材的ESR图谱为典型的无超精细分裂的粉状图谱，与Felby等5得到的木纤维的ESR谱图相同。其g值为2.0038，与酚氧自由基的g值相同。而图2漆酶处理枫香木材悬浮液的自由基与图1明显不同

13、，其g值为2.005，aN=15.0G。自旋捕捉剂PBN能捕捉超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂类自由基以及其他活性氧类自由基。PBN与活性氧类自由基加合物（PBN-ROS spin adduct）ESR谱图为三到六线峰的谱图，g值为2.005，aN=15.0G10-11。故图2中谱图为典型的PBN与活性氧类自由基加合物的ESR谱图。2.2 漆酶处理枫香木材的自由基浓度的变化如图3所示，与对照 (16.87±1.69)mm相比，pH 3.47的漆酶处理后(33.23±4.8)mm, P<0.01) 枫香木材悬浮液中活性氧类自由基 (ROS，Reactive oxygen

14、 species)自由基浓度升高了97%；pH 6.5的漆酶处理后(23.03±4.93)mm, P=0.11)ROS自由基的浓度升高了36.6%,，表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.5时的好。单因素方差分析表明,pH值对漆酶处理思茅松边材产生ROS自由基的浓度有影响(P<0.01,图3)。2.3 漆酶处理思茅松木材的自由基浓度的变化 思茅松边材如图3所示，与对照组(62.7±15.62)mm相比，经pH 3.47的漆酶处理后(138±12.29)mm, P<0.01) 思茅松边材悬浮液中ROS自由基的浓度升高了120%；经pH 6.5的漆酶

15、处理后(70.9±7.82)mm, P=0.46)ROS自由基的浓度升高了13%,表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.5时的好。单因素方差分析发现,pH值对漆酶处理思茅松边材悬浮液中ROS自由基的浓度有影响(P<0.01,图3)。10G 10G 图2. 漆酶处理枫香木材悬浮液中PBN-ROS自旋加合物的ESR谱图（pH3.47）Fig.2 ESR spectrum of PBN-ROS spin adduct in suspension liquid of Liquidambar formosana wood treated by laccase at pH3.47 图

16、1. 漆酶未处理枫香木材的ESR谱图Fig.1 ESR spectrum of untreated Liquidambar formosana wood 思茅松心材如图3所示，与对照组(53.43±4.5)mm相比，pH 3.47的漆酶处理后(135.67±15.8)mm, P<0.01) 思茅松心材木粉悬浮液中ROS自由基的浓度升高了154%；pH 6.5的漆酶处理后(64.2±3.55)mm，P<0.05)ROS自由基的浓度升高了20%，表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.5时的好。单因素方差分析发现，pH值对漆酶处理思茅松心材产生ROS自

17、由基的浓度有影响(P<0.01,图3)。2.4 不同树种木材漆酶处理后自由基浓度的变化比较如图4所示，思茅松边材的ROS自由基的浓度最大，思茅松心材的次之，而枫香木材的最小。单因素方差分析显示不同树种木材悬浮液中ROS自由基的浓度差异显著（P<0.01，图4）。这说明漆酶处理产生ROS自由基与树种密切相关，思茅松边、心材漆酶处理效果优于枫香木材，而漆酶处理对思茅松心、边材产生ROS自由基的大小没有显著性影响。A1-A3：Liquidambar formosana ；A1,double distilled water(control)；A2, laccase-treated at p

18、H 3.47；A3, laccase-treated at pH 6.50.B1-B3: Pinus kesiya var. langbianensis sapwood；B1, control；B2, laccase-treated at pH 3.47；B3, laccase-treated at pH 6.50.C1-C3: Pinus kesiya var. langbianensis heartwood；C1, control；C2, laccase-treated at pH 3.47; C3, laccase-treated at pH 6.50.Each value repres

19、ents (±s) for 3 samples in each group. * *: vs. A1, P<0.01. #: vs. B1, P<0.01. : vs. C1, P<0.01. : vs. C1, P<0.05.图3. 不同pH值的漆酶液处理的木粉悬浮液中PBN-ROS自旋加合物的浓度Fig.3 Strengths of PBN-ROS spin adduct in the suspension liquid with woodflours treated by laccase solutions at different pHsA2-C2：A

20、2, Liquidambar formosana woodflour laccase-treated at pH 3.47; B2, woodflour of Pinus kesiya var. langbianensis sapwood laccase-treated at pH 3.47; C2, woodflour of Pinus kesiya var. langbianensis heartwood laccase-treated at pH 3.47.Each value represents (±s) for 3 samples in each group. *: vs

21、. A2, P<0.01.图4. 漆酶液处理不同树种木材悬浮液中PBN-ROS自旋加合物的自由基浓度（pH3.47）比较Fig.4 ROS intensity of PBN-ROS spin adduct in the suspension liquid with different wood species laccase-treated at pH 3.473 结 论（1）天然木材的自由基为酚氧自由基，而漆酶处理木材试样产生了活性氧类（ROS）自由基.。（2）漆酶处理三种木材均能产生ROS自由基,且pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.5时的好。（3）漆酶处理产生ROS自由基与树种

22、密切相关，思茅松边、心材漆酶处理效果优于枫香木材，而漆酶处理对思茅松心、边材产生ROS自由基的大小没有显著性影响。这表明漆酶活化木纤维生产纤维板时应根据具体木材树种确定最佳的漆酶处理条件。参考文献1 Yaropolov A I, Skorobogatko O V, Vartanov S S et al. Laccaseproperties, catalytic mechanism, and applicability. Appl Biochem Biotechnol, 1994, 49(3):2572802 Felby C, Pedersen L S, Nielsen B R. Enhance

23、d auto adhesion of wood fibers using phenol oxidases.Holzforschung,1997, 51(3)：2812863 Ferm R, Kringstad K P, Cowling E B. Formation of free radicals in milled wood lignin and syringylaldehyde by phenol oxidizing enzymes. Sven Papperstidn, 1972, 14(4): 8598654 Kleinert T NStable free radicals in var

24、ious lignin preparations. TAPPI, 1967, 50(1):1201225 Felby C, Nielsen B R, Olesen P O, et al. Identification and quantification of radical reaction intermediates by electron spin resonance spectrometry of laccasecatalyzed oxidation of wood fibers from beech. Appl Microbiol Biotechnol,1997,48(4):4594646 Amer G I, Drew S W. The concentration of extracellular superoxide radical as a function of time during lignin degradation by the fungus Coriolus versicolor. Dev Ind Microbiol, 1980,22(3):4794847 Bes B,