骨髓间充质干细胞对异体B 淋巴细胞增殖和分泌免疫球蛋白的影响

1、骨髓间充质干细胞对异体 B 淋巴细胞增殖和分泌免疫球蛋白的影响摘要：摘要：目的：探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells, MSCs)在体外对异体外周血 B 淋巴细胞增殖和分泌免疫球蛋白的影响。方法：用密度梯度离心法从骨髓中分离、培养 MSCs，从外周血中分离单个核细胞， L-亮氨酸甲酯去除单核细胞，以 2-氨乙基硫脲溴化物（AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）花环形成法，去除 T 淋巴细胞获得纯化的 B 淋巴细胞。用羊抗人 IgM 单克隆抗体（Anti-IgM）刺激与或未与 MSCs 及其培养上清共培养 3 天的 B 淋巴细胞，应用 MTT 法

2、测 B 淋巴细胞的增殖，ELISA 法测培养上清中免疫球蛋白 IgG、IgM 的产生。 结果：MSCs 及其培养上清抑制由 Anti-IgM 诱导的 B 淋巴细胞的增殖和分泌 IgG、IgM，且随着 MSCs 细胞数量及其培养上清浓度的增加，这种抑制越明显。结论：MSCs 抑制异体外周血 B 淋巴细胞的增殖和分泌免疫球蛋白，提示 MSCs 对外周血 B 淋巴细胞存在免疫调节作用，其作用机制与 MSCs 分泌的细胞因子有关。关键词：关键词：间充质干细胞；B 淋巴细胞；免疫球蛋白1.1. 引言引言间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的具有高度自我

3、更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，存在于成体骨髓、脂肪、肌肉等多种组织，以骨髓组织中含量最为丰富。近期的研究表明，MSCs 具有低免疫原性和免疫抑制作用。体外试验已经证实不同组织来源、不同种属的 MSCs 可抑制多种免疫细胞如 T 淋巴细胞、NK 细胞以及树突状细胞的活化、增殖和发育1,2,3。因此，人骨髓 MSCs 已经应用于临床试验，以期治疗骨髓移植后移植物抗宿主病、克隆氏病等免疫相关性疾病。但有关 MSCs 的一些生物学特性及免疫调节作用机制仍未阐明，尚须进一步研究。B 淋巴细胞是另一重要的免疫效应细胞，MSCs 是否也对其存在免疫调节作用，目前国内外对此研究的报道较少，并且结果也不一

4、致。本实验通过研究骨髓源 MSCs 对异体外周血 B 淋巴细胞增殖、分泌免疫球蛋白的影响，初步探讨 MSCs 对 B 淋巴细胞的免疫调节作用。2.2. 材料与方法材料与方法2.1 材料人淋巴细胞分离液（天津灏洋，比重 1.077g/ml），RPMI-1640、LG-DMEM（Gibco 公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司），PE 或 FITC 标记的鼠抗人流式单克隆抗体（PharMingen 公司），羊抗人 IgM 单克隆抗体（Anti-IgM）、L-亮氨酸甲酯、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、2-氨乙基硫脲溴化物（AET）、植物血凝素（PHA）均购自 Sigma 公司，丝裂霉素 C（罗氏公司

5、）。人免疫球蛋白定量 EIA 试剂盒购自北京尚柏生物医学技术公司。绵羊血红细胞取自兰州大学实验动物中心。酶标仪（Wellseav MK2 型全自动酶标仪，Labsystem），流式细胞仪为 Beckman Coulter 公司产品。2.2 方法2.2.1 间充质干细胞的分离、培养及鉴定无菌取健康成人自愿供者骨髓，肝素抗凝， LG-DMEM 培养液适当稀释后，以人淋巴细胞分离液分离骨髓中的单个核细胞，用 LG-DMEM 培养液洗涤 2 次后计数，按 2105 细胞/ml 的密度接种于 25cm2 培养瓶中，培养体系为含 10%FBS 的 LG- DMEM。在 37、含 5%CO2、饱和湿度条件下

6、培养。48 小时后首次换液去除非贴壁细胞。此后每隔 23d 换液 1 次，待贴壁细胞达瓶底 80%90%融合时，以 0.25 %胰蛋白酶消化传代，按 12 比例分瓶进行传代培养，并标记为 P1 细胞，传至第 35 代的细胞备用。用 0.25%胰蛋白酶消化收获细胞培养至第 3 代的细胞，PBS 洗涤计数后，分别与 PE 或 FITC 标记的鼠抗人 CD3、CD13、CD14、CD22、CD33、CD34、CD44、HLA-DR 单克隆抗体，以流式细胞仪检测细胞表面标记，具体操作按试剂说明书进行。Cell-Quest 软件分析，每个样本至少分析 10000 个细胞。2.2.2 人外周血 B 淋巴细

7、胞的分离及纯度检测参照文献4，常规法分离正常人外周血单个核细胞后，用 L-亮氨酸甲酯去除单个核细胞中的单核细胞，再与经 AET 处理的新鲜绵羊血红细胞，以两次AET-SRBC 的花环形成分离法去除 T 淋巴细胞，获得纯化的 B 淋巴细胞。分离后的 B 淋巴细胞用 PE 标记的 CD19 单抗进行标记，流式细胞仪鉴定。TrypanBlue 染色法鉴定细胞活力，用含 10%FBS 的 RPMI-1640 培养基重悬备用。经 AET-SRBC 花环形成分离的沉淀细胞经 Tric-NH4CL 低渗除去红细胞，得到纯化的 T 淋巴细胞。调整 T 淋巴细胞浓度为 2106/ml，种于 25cm2 培养瓶中

8、，培养体系为含 10% FBS 的 RPMI-1640，加入终浓度 100g/ml 的 PHA，72h 后作为活化的 T 淋巴细胞（Ta）收集上清备用。2.2.3 MSCs 及其培养上清液对 B 淋巴细胞增殖的影响将培养至 3 代5 代的 MSCs，加入终浓度为 25 mg/L 的丝裂霉素 C，以去除其增殖分化能力，37水浴，孵育 30 min，用完全培养基洗涤 3 次，去除残余的丝裂霉素 C。用胰酶消化后洗涤、计数，制成 2104 个细胞/ml（MSCs）、105 个细胞/ml（MSCs）、106 个细胞/ml（MSCs）不同细胞浓度的悬液，100l /孔接种于 96 孔板，待细胞完全贴壁后

9、吸去上清，将分离得到的 B 淋巴细胞制成 106 个细胞/ml 的悬液 100l/孔接种于上述各孔，并加入 Anti-IgM 至终浓度 10g/mL，培养体系均为含 10 % FBS 的 RPMI-1640培养基。收集第 3 代，处于对数生长期、培养 3d 的 MSCs 培养上清液，配制含 12.5%（super1）、25%（super2）、50%（super3）MSCs 上清及 10% FBS 的RPMI-1640 培养基，用以上培养基调整 B 淋巴细胞浓度为 106 个细胞/ml，100l/孔加入以上同一 96 孔板，同时加入 Anti-IgM 至终浓度为 10g/mL。设 B 淋巴细胞加

10、 Anti-IgM 为阳性对照。将培养板放置于 37、5 % CO2 饱和湿度孵箱中培养 68 h 后，加入 MTT （5mg/ml）20l/孔，继续孵育 4h，1000r/min 离心培养板 10min，弃去孔内培养液。每孔加入 150l 二甲基亚砜（DMSO），振荡 10min，酶标仪 493nm 处读 A 值。2.2.4 MSCs 及其培养上清液对异体 B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白的影响将丝裂霉 C 处理的培养至 35 代的 MSCs 调成 105 个细胞/ml（B 淋巴细胞与 MSCs 以不同比例体外共培养，B:MSCs 10:1）、 106 个细胞/ml（B:MSCs1:1），按每孔

11、1ml 分别加入 24 孔板中，完全贴壁后，按上述方法制备浓度为106 /ml B 淋巴细胞，每孔 1ml 加入上述各孔，培养体系为 10% FBS 的 RPMI-1640。 再将含 25%、50% MSCs 培养上清液及 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基将B 淋巴细胞制成 106 /ml 的细胞悬液，加入同一 24 孔板中。同时各孔加入终浓度为 10g/ml Anti-IgM 和 PHA 活化的 T 淋巴细胞培养上清 200l，设 B淋巴细胞加 Anti-IgM 和 T 淋巴细胞培养上清作为对照，体系中不足量以培养基补足。将培养板放置于 37、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养 1

12、68h 后，收获上清用酶联免疫吸附法（ELI1SA）检测培养上清中 IgG、IgM 的含量，具体操作参照试剂盒说明书。2.2.5 统计学方法所有数据以均数标准差表示。使用 SPSS10.0 软件分析结果，组间比较采用配对 t 检验或单因素方差分析。3.3. 结果结果3.1 间充质干细胞的分离、培养及鉴定从骨髓分离的单个核细胞接种 24h 开始贴壁，23d 出现梭形贴壁细胞，培养 23w 达到 8090融合。传代的细胞于 1224 小时内完全贴壁，7d 左右达到 8090融合，细胞形态均一呈长梭形，核仁明显，核染色质疏松。流式细胞术检测 MSCs 细胞的表面抗原结果显示，高表达 CD44、CD1

13、3，而 CD3、CD14、CD22、CD33、CD34、HLA-DR 表达阴性。3.2 人外周血 B 淋巴细胞的分离及纯度检测经流式细胞术检测，纯化后外周血单个核细胞中 CD19B 淋巴细胞含量为80.75。Trypan Blue 染色后显微镜下计数，细胞活力90。3.3 MSCs 及其培养上清液对 Anti-IgM 刺激的异体 B 淋巴细胞增殖的影响用 10g/ml Anti-IgM 刺激与或未与 MSCs 共培养 3d 的 B 淋巴细胞，各组 B 淋巴细胞的增值情况。MSCs 抑制 B 淋巴细胞的增殖，并且这种抑制作用与 MSCs 的数量及其上清液浓度有关。未加 MSCs 的对照组 A 值

14、为（0.6790.050），与 MSCs、MSCs、MSCs共培养的 B 淋巴细胞，各组 A值分别为（0.5450.120）、（0.4180.103）、（0.3650.114）。MSCs、MSCsA 值组明显低于对照组(P0.01), 并且 MSCs组 A 值显着低于MSCs组(P0.05)。用含有 12.5%（super1）、25%（super2）、50%（super3）不同 MSCs 培养上清液浓度的培养基培养 3d 后，各组 B 淋巴细胞的 A 值为（0.6691.023）、（0.6170.063）、（0.5040.099）。其中super3 同对照组相比有统计学意义(P0.05), 并

15、且显着低于 super1 组(P0.05)。3.4 MSCs 及其培养上清液对异体 B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白的影响MSCs 及其培养上清液对异体 B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白的影响不同组 B淋巴细胞分泌 IgG、IgM 的水平，MSCs 及其培养上清液抑制 B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白。与对照组相比，B:MSCs 1:1 组及 50%super 组分泌的 IgM 明显减少（P0.01）。而对分泌 IgG 的影响，只有 B:MSCs 1:1 组分泌的 IgG 同对照组相比差异有统计学意义（P0.05）。4.4. 讨论讨论B 淋巴细胞，是免疫系统中的抗体产生细胞，介导体液免疫应答。此外，B淋巴细胞还

16、具有抗原提呈功能，活化的 B 淋巴细胞能产生多种细胞因子参与免疫调节，在炎症反应、造血过程中也有重要作用，是机体另外一种重要的免疫效应细胞，并且 B 淋巴细胞在一些疾病的发生发展中起着重要作用。MSCs 的多向分化潜能、促进造血干细胞（HSC）增殖并可能促进造血干细胞移植（HSCT）后的细胞植活5、低免疫原性、抑制同种异体免疫反应、减轻移植物抗宿主效应的作用6使其成为近来干细胞研究的热点。MSCs 的免疫调节的作用，以针对 T 淋巴细胞的研究为多。研究 MSCs 对 B 淋巴细胞的免疫调节作用，为进一步探讨 MSCs 的免疫调节活性是非常必要的。我们利用 MSCs 的黏附特性从骨髓单个核细胞中

17、分离此类细胞，利用其克隆样生长和成纤维样细胞的形态进行体外扩增、纯化，由于尚未发现 MSCs 高度特异性的表面标记，对于 15 代的 MSCs，我们通过观察细胞生长特性，流式细胞仪测定 CD44、CD13、和 CD3、CD14、CD22、CD33、CD34、HLA-DR 一些公认的阳性及阴性标记，结果表明获得的此类细胞符合 MSCs 的性质。在体外我们用羊抗人 IgM 单克隆抗体刺激培养的外周血 B 淋巴细胞，结果显示 MSCs 及其培养上清明显抑制 B 淋巴细胞的增殖，并且这种抑制作用与MSCs 的数量及其上清的浓度有关。这一结果与 Corcione 等7报道的一致，并且也与 MSCs 在体

18、外抑制由非特异的丝裂原引起的 T 淋巴细胞增值相似。邓为民等8在 BALB/C 小鼠的骨髓源 MSCs 对 BALB/C 小鼠（同基因正常）、C57BL/6 小鼠（异基因正常）及 BXSB 小鼠（异基因自身免疫病）小鼠的 B 细胞功能影响的研究中发现， MSCs 对同基因和异基因正常小鼠由脂多糖 LPS 诱导的 B 细胞分泌 Ig 的能力有促进作用；对异基因自身免疫病小鼠由脂多糖LPS 诱导的 B 细胞 Ig 分泌具有抑制作用。本实验用羊抗人 IgM 单克隆抗体加PHA 活化的 T 淋巴细胞上清共同诱导体外培养的外周血 B 淋巴细胞产生 Ig，研究结果显示，MSCs 及其培养上清抑制正常人外周

19、血 B 淋巴细胞分泌 Ig，同样我们的结果和 Corcione 报道的一致。此实验还发现 MSCs 及其培养上清抑制B 淋巴细胞分泌 Ig 的作用与 MSCs 的数量及其上清的浓度有也存在关系。对于 MSCs 的免疫调节机制，许多学者从多方面进行了探讨，但尚未阐明。在 MSCs 对 T 淋巴细胞免疫调节作用的研究中，MSCs 的免疫调节机制集中在细胞间的相互作用9和 MSCs 分泌的 TGF-、HGF 等细胞因子上10, 11。本试验观察到 MSCs 的培养上清对外周血 B 淋巴细胞的增殖和 Ig 的分泌起到一定的负性调节，提示 MSCs 分泌的可溶性细胞因子参与其中。通过本实验我们观察到骨髓

20、源 MSCs 对正常人外周血 B 淋巴细胞存在负性调节，这为进一步探讨 MSCs 的免疫调节作用奠定了基础。但是，MSCs 对自身免疫性疾病患者 B 淋巴细胞是否有同样的调节作用，以及输入体内的 MSCs 在复杂的微环境中又会表现什么样的免疫调节特性，尤其是作用机制的阐明尚须大量的研究工作。十年论文机构京都名师论文中心，正规全面的论文刊物为您提供职称论文，毕业论文，硕士论文，医学论文，教育论文等各类论文发表服务。参考文献参考文献1 Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cellsmodulate allogeneic immune c

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