灵芝三萜的提取分离及总三萜的含量测定(精)

1、 70现代中药研究与实践2010 年第 24 卷第 5 期 Chin Med J Res Prac,2010Sept.,Vol.24 No.5灵芝是一种名贵的药用真菌，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，始载于 ?神农本草经 ?，具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效。灵芝主要成分为多糖类和三萜类。三萜类成分复杂，曾祥丽等 1 报道灵芝含有 122 种三萜类成分，其中最主要是灵芝酸 37 种。林志彬等研究认为灵芝三萜具有抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、保肝、抗肿瘤和抗艾滋病毒等药理活性 2-5 。本文对灵芝三萜的提取分离及总三萜的含量测定作以下报道。1 仪器、

2、试剂旋转蒸发仪（日本生产，EYELA ROTORYEVAPOPATOR N-1000 ）； GB204 电子天平（瑞典）； 751 型紫外 -可见分光光度计（上海分析仪器灵芝三萜的提取分离及总三萜的含量测定侯敏娜 1，刘 剑 2（ 1.陕西国际商贸学院， 陕西 咸阳 712046； 2. 陕西香菊药业集团责任公司，陕西 商洛 726000）摘要：目的 研究灵芝三萜的最佳提取方法，并测定其总三萜的含量。用正交实验方法，方法 采用硅胶柱进行总三萜分离，通过紫外 -可见分光光度法测定总三萜含量。 结果最佳提取方法为用 5 倍量 95%乙醇回流提取 3 次，每次 1.5 h ；用 30 倍量硅胶装柱，

3、以石油醚 -乙酸乙酯（ 9：1 和 7： 3）进行洗脱；经分离得到针状晶体和，测定该品种中灵芝总三萜含量为 9.07%。 结论 本提取方法稳定可行，可作为灵芝三萜工业化生产的参考。关键词：灵芝三萜 ; 提取分离 ; 含量测定中图分类号：S567.3+1 文献标识码： A 文章编号： 1673-6427(201005-0070-02 Ganoderma Triterpenoids Extraction and Determination of the Total TriterpenoidHOU Min- na1 , LIU Jan2(1.Shan anxi Institute of Intern

4、ational Trade & Commerce, Xianyang 712046, China ;2. Shan anxi Xiangju Pharmaceutical Group Co., Shangluo 726000,ChinaAbstract: Objective To design the best out of Ganoderma triterpenoids extract programs and separation methods, and measured the total content of triterpenoid. Methods Filter thro

5、ugh the orthogonal extraction method, using silica gel column for the total separation of triterpenoids by ultraviolet - visible spectrophotometry triterpenoid content. Results The optimum extraction method is to use ? ve times the amount of 95% ethanol was extracted three times for 1.5 hours each t

6、ime; loaded with 30 times the amount of silica gel column with petroleum ether - ethyl acetate (9:1 and 7:3 for elution; by ultraviolet - visible spectrophotometry in order to ursolic acid as a reference substance, the total triterpene content of Ganoderma lucidum were determined. Conclusion The ext

7、raction method is stable and feasible, and Ganoderma triterpene content was to 9.07%.Key words: Ganoderma lucidum Triterpenes; extraction and separation; content determination 厂）；硅胶 G （青岛高能达化工有限公司）；薄层层析硅胶板HSGF254（烟台江友硅胶开发有限公司）、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等试剂均为分析纯，熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所）。2 方法2.1 灵芝三萜的提取方法灵芝三萜属于脂溶性成分，通

8、常用有机溶剂进行提取。本实验对提取溶剂、提取次数、时间及其用量4 个试验因素，每个因素设3 个水平，以熊果酸为对照品测得的总三萜含量作为考察指标，选用 L 9 （34）正交试验表安排试验。因素与水平见表 1，实验方案见表 2。收稿日期： 2009-10-20作者简介：侯敏娜（ 1981-），女， 硕士研究生，主要从事药物制剂教学和研究工作。表 1 因素水平表 Tab.1 Factors and level水平123提取溶剂A 氯仿 95%乙醇甲醇提取时间（ h）B 11.52.0提取次数（次） C 123溶剂用量（倍）D 357 71现代中药研究与实践2010 年第 24 卷第 5 期 Chi

9、n Med J Res Prac,2010Sept.,Vol.24 No.5各因素对灵芝总三萜提取工艺影响大小为： C>B >A>D ，经各方面综合考虑后，最终选出最佳提取工艺为： 5 倍量 95%乙醇回流提取 3 次，每次 1.5 h。2.2 灵芝干浸膏制备方法 称取干燥灵芝粗粉 4 000 g ，加入 5 倍量的 95%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，过滤，滤液水浴（ 5060 ）蒸干得浸膏 345.26 g，加水使充分溶解，用等量的氯仿萃取 3 次，合并氯仿层，减压回收至适量，水浴（ 5060 ）蒸干得浸膏 82.86 g。2.3 灵芝三萜的分离方法 将上面所得浸膏

10、用适量乙酸乙酯充分溶解，挥至少量 , 用 2 倍量硅胶拌样， 30 倍量硅胶装柱，先用石油醚 -乙酸乙酯（ 9：1）洗脱，洗脱液每 100 mL 收集一次，至洗脱液近无色（在硅胶 HSGF 254 板上点样无斑点显示）时，再用石油醚 -乙酸乙酯（ 7：3）洗脱，合并第 49 至 73 流份，减压回收至少量，自然挥干，得粗晶 4.139 3 g，用少量乙酸乙酯溶解， 2 倍量硅胶拌样， 100 倍量硅胶装柱，用石油醚 -乙酸乙酯（ 7： 3）洗脱，洗脱液每 30 mL 收集一次，合并第 933 和 3444流份，分别减压回收至适量，用甲醇反复重结晶，可得白色针状晶体 (1.862 4 g和白色针

11、状晶体 (0.546 8 g。3 灵芝总三萜的含量测定3.1 标准曲线的制备 取熊果酸对照品 1.15 mg，溶于 10.00 mL 乙酸乙酯中，混合均匀得对照品溶液。分别吸取 0.00、 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、 1.00 和 1.20 mL 对照品溶液，在 100水浴上蒸干后加入 0.40 mL 5香草醛一冰乙酸溶液和1.00 mL 高氯酸，于 60 水浴中加热 15 min 后移入冰水浴中，再加入 5.00 mL 冰乙酸，摇匀后置于室温。 15 min 后，用紫外 -可见分光光度计在 548.1 nm 波长下测定其吸光度。根据测定结果绘制标准曲线。对照品重量在0

12、0.14mg 范围内与吸光度值呈良好的线性关系，其线性回归方程为Y =0.140 8X+0.002 6，相关系数 r =0.999 1。3.2 直接光度法测定 取灵芝样品 5.0010.00 mg，溶于 10.00 mL 乙酸乙酯中。分别吸取定体积的该溶液，在 100 水浴上蒸干后加入 0.40 mL 5香草醛一冰乙酸溶液和 1.00 mL 高氯酸，于 60 水浴加热 15 min 后移入冰水浴中，再加入 5.00 mL 冰乙酸，摇匀后置于室温。 15 min 后用紫外 -可见分光光度计在 548.1 nm 波长下测定样品溶液的吸光度。结果表明，该品种灵芝中总三萜含量为 9.07%。4 结论灵

13、芝的药用成分，主要是其中含有的多糖和三萜成分，而三萜化合物分子功能团较多，结构复杂多样且不稳定，容易随温度的变化而改变，所以在提取时温度的控制是关键。灵芝三萜具有广泛的药理活性 6，它的提取分离已基本上完成，但是，对于具体灵芝三萜的结构确定及其药理作用的研究有待下一步完成。参考文献1 曾祥丽 , 包海鹰 . 灵芝三萜类成分与药理学研究进展 J.菌物研究,2004,2(1:68-77.2 罗 俊 , 林志彬 .灵芝三萜化合物药理作用研究发展 J. 药学学报 ,2002,37(7:42-46.3 El-Mekkawy S,Meselhy,Nakamura N,et a1.Anti-HIV-1 an

14、d anti-HIV-1-protease from Ganoder maluciduma J, Phytochemistry.1998,49 (6:1651-1657.4 王 斌 , 胡岳山 , 李杰芬 .灵芝三萜对小鼠脾脏树突状细胞增殖的影响 J.中药材 ,2005,28(7:21-25.5 周昌艳 , 唐庆九 , 杨 焱, 等. 灵芝中有效成分灵芝酸的抑制肿瘤作用研究J.茵物学报 ,2004,23(2: 275-279.6 马 林 , 吴 丰, 陈若芸 .灵芝三萜成分分析 J.药学学报 ,2003,38(1:61-68.表 2 L9（34）正交试验表 Tab.2 Results of the orthogonal test列号123456789 RA11122233326.3626.6926.840.48B 12312312326.3727.2826.360.92C 12323131225.5326.5127.872.34D 12331223126.572