实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡

1、实验二 双水相萃取 -淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求1掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。 2了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸铵体系双水相萃取实验操作。4明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 等因素对 -淀粉酶分配系数的影响。 二、实验器材和试剂1. 实验器材 :低速离心机;酸度计;涡流混合器;分光光度计2. 实验试剂 :PEG :(分子量分别为 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸铵、 -淀粉酶、 磷酸氢二 钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理双水相萃取技术

2、在萃取胞内酶中应用广泛,最常采用的双水相体系是 PEG/Dex或 PEG/低分子盐系统, 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。 PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。 T 为上相浓度, B 为下相浓度 , C 为系统临界点, TCB 为临界线 或双节线,双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水 相萃取分配系数 K=Ct /Cb ,为上相和下相的浓度比。双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和 离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得 特

3、定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。相图中 TMB 为系线,其长度由相组成的总浓度决定,表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋 近于零,表示上相和下相的组成相同,因此分配系数应为 1。随着 PEG 、硫酸铵和盐浓度增大,系线长度 增加,上相和下相相对组成的差别就增加,酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究 -淀粉酶的分配,具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和 添加 NaCl 浓度对 -淀粉酶分配系数的影响。参考:-淀粉酶是广泛应用的生物酶类, B.Subtilis 细菌 -淀粉酶是研究和应用较多的 -淀粉酶, 其分子量为 4

4、8 KD , PI 约为 5,最适 pH5.3-6.4,在 pH4.8-8.5之间稳定。四、实验步骤1. PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制(全班都做配制 40%PEG1000和 43%硫酸铵原液(没有混合前的液体,混合后浓度是相图中最终浓度,分别取0.7gPEG1000、 2000、 4000、 6000原液(PEG10002000、 4000、 6000密度分别为 1.037g/mL、 1.066 g/mL 、 1.03 g/mL 、 1.07,因此加入 0.7g 对应体积分别为 0.68 mL、 0.66mL 、 0.68 mL、 0.66 mL ,加入 0.5mL 水,按图 1流程绘制相

5、图,按表 1记录数据。注意少量多次加入硫酸铵原液,系统出现浑浊时记录加入硫 酸铵体积,计算重量(43%硫酸铵原液密度为 1.2g /mL , 再加入适量水,使体系变澄清,计量加入的水, 再加硫酸铵,使系统再次变混浊,如此反复操作,原液冰箱放置。将数据记录到表 1中,计算系统混浊不 同时刻 PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分浓度(或质量体积百分比 ,绘制 PEG 和硫酸铵的双水相相图。第 1组同学做 PEG 分子量 1000的相图,第 2、 3、 4组分别做 PEG 分子量 2000、 4000和 6000的相图。 图 1 PEG/硫酸铵双水相相图绘制流程表 1 PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制

6、数据 按图 2流程,配制 40%PEG2000、 4000、 6000和 8000和 50%硫酸铵原液,混合后双水相体系为 PEG4000 (20%g/mL 硫酸铵 (25%g/mL。分别取 4mL PEG和硫酸铵原液各 2份,一份做上下相空白样,加入 0.5mL 水, 另一份加入 0.5mL 淀粉酶用于双水相分配置于 15mL 刻度离心管中轴向充分混合, 3000r/min离心 4min ,读 出上下相体积,计算相比。小心吸取上相 1mL, 加入 3mL 考马斯亮蓝,测定 595nm 下的吸光度 A 值。移去上相,弃去相界面处液体和 少量下相,小心吸取下相 1mL, 加入 3mL 考马斯亮蓝

7、,测定 595nm 下的吸光度 A 值。添入表 2,计算分配系数 , 绘制趋势图。 (实验 2、 3、 4、 5步骤均采用此方法测定上下相吸光度值,根据蛋白浓度标准曲线方程计算 出酶浓度标准曲线方程Y= 0.8292 X + 0.0272PEG10000.700g2O混均 图 2 不同变量对双水相萃取 -淀粉酶分配系数影响操作流程 表 2 不同 PEG 分子量对双水相萃取 -淀粉酶分配系数的影响 3分别取 4mL40%PEG4000和 50%硫酸铵原液 8份, 按表 3加入不同 NaCl 浓度后, 空白样加入 0.5mL 蒸馏 水,样品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度离心管中轴向充

8、分混合, 3000r/min离心 4min ,读上下相体积, 计算相比。按步骤 2测定上下相中淀粉酶吸光度,按标准曲线计算浓度和 -淀粉酶分配系数。4. 不同硫酸铵浓度对双水相萃取 -淀粉酶分配系数的影响(第 3组表 4 不同硫酸铵浓度对 -淀粉酶分配系数台称 总重 8.5mL求相比R =V上 /V下样品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度离心管中轴向充分混合, 3000r/min离心 4min ,读上下相体积,计 算相比。按步骤 2测定上下相中淀粉酶吸光度,按标准曲线计算浓度和 -淀粉酶分配系数。5. 不同 pH 值对双水相萃取 -淀粉酶分配系数的影响(第 4组取 4mL40%PEG

9、4000 8份,按表 5分别加入不同 pH 值含 50%硫酸铵原液各 2份,空白样加入 0.5mL 蒸 馏水,样品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度离心管中轴向充分混合, 3000r/min离心 4min ,读上下相体 积,计算相比。按步骤 2测定上下相中淀粉酶吸光度,按标准曲线计算浓度和 -淀粉酶分配系数。 对于 PEG4000 (15%g/mL 硫酸铵 (25% g/mL体系,按表 5记录不同 pH 值时 -淀粉酶分配系数。 五、实验注意事项1.加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇,直至固体全部溶解。2. 上下相分离时注意吸管小心吸出上相,将多余上相和少量下相弃去,换吸管,吸出

10、下相。六、思考题1.常用双水相体系有哪些? 2.双水相体系形成的过程?3.双水相体系形成的原因?4.分析 PEG 分子量、浓度、 pH 、添加 NaCl 和酶浓度等因素对 -淀粉酶分配系数的影响。 %1. 穿实验服、预习实验、不要大声喧哗。2. 下午一点半 2个班同时到实验室, 1班在 607,2班在 608. 统一在 608讲解后分别做实验。3. 每组任务:相图,一个变量对分配系数的影响, 1-4组分别做步骤 2、 3、 4、 5.4. 为避免分光光度计使用时间冲突,每班第 1组先做变量影响,每 45分钟后轮换下一组使用。5. 每组选组长领药品,实验结束后洗干净交回。每班第 3-4组值日。签

11、到后检查无误给成绩。 % 准备试剂:(4个班40%PEG1000、 2000、 4000和 6000 各 200mLL 。 (试剂瓶装每个 2瓶 43%硫酸铵原液 500mL, 每组分成 4个小试管分装,每管 4mL 。50%硫酸铵原液 150Ml, 每组分成 4个小试管分装,每管 4mL 。pH 值分别为 4.8、 5.5、 7.0、 8.5的磷酸盐缓冲液 100mL. (用于配 50%硫酸铵原液每组各 4mL, 共 4组 NaCl 浓度 0.085g 、 0.2125g 、 0.425g 、 0.663g ,各 4份 , 共 4组。考马斯亮蓝 G-250 800mL, 每组 100mL. (100mg 考马斯亮蓝、 85%磷酸 120Mml95%乙醇 50mL, 定容至 1L 1%-淀粉酶 10mL (每组 4份,每份 0.5mL 装在 1mL 离心管中20%、 30%、 40%、 50%硫酸铵各 100mL. (每组各 4mL