第一届实验室培训2DE安排

1、第一届全国先进电泳及其质谱联用新技术培训研讨会实验流程-2DE一、 培训内容：双向凝胶电泳技术培训，包括1、新型等电聚焦电泳仪器，2、高分辨IEF新技术，3、高分辨2DE新技术二、 培训时间：8:30-11:50AM（3h20min），1:30-5:20 PM（3h50min）三、 地点：生物医药楼4326四、 每次培训预定人数：18人五、 培训准备时间安排：注：同一组颜色为一组培训内容，灰色为准备工作。测试样品为IEFmarker。IEF仪器为伯楷安IEF仪。IPG为伯楷安IPG，pH3-10,7cm。PAGE预制胶为伯楷安PAGE预制胶，well 孔，12%。A. 21号8：30，水化胶条

2、12根。B. 21号20：30，水化胶条12根。C. 21号22：30，聚焦电泳12根。D. 22号8：30聚焦结束。E. 8:30胶条平衡。F. 9:20转移第二向。G. 9:50聚焦电泳12根。H. 10:20技术讲解及仪器使用。I. 10:50凝胶固定染色。J. 11:20胶条水化12根。K. 13:30技术讲解。L. 14:00胶条平衡。M. 14:50转移第二向。N. 15:20胶条水化12根。O. 15:50讲解仪器使用。P. 16:30凝胶固定染色。Q. 22:30聚焦12根。R. 23号8:30聚焦结束。S. 8:30胶条平衡。T. 9:20转移第二向。U. 9:50聚焦电泳1

3、2根。V. 10:20技术讲解。W. 10:50凝胶固定染色。X. 11:20胶条水化6根。Y. 13:30技术讲解。Z. 14:00胶条平衡。AA. 14:50转移第二向。BB. 15:20胶条水化6根。CC. 15:50参观染色结果DD. 16:20凝胶固定染色。EE. 16:50讲解仪器使用附件1：实验报告附件2：2DE溶液配制附件3：实验室发表文章另附：伯楷安PAGE预制胶使用说明上海交通大学生化分析与分离实验室附件1：实验三 双向凝胶电泳分离IEF标准蛋白目的要求（1）通过IEF标准蛋白的分离，理解2DE分离原理。（2）了解并掌握2DE技术的全程操作方法。实验原理双向电泳（2DE）是

4、分析从细胞、组织或者其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分离。第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）中利用蛋白质的分子量（Mr，相对分子量）大小将它们分离。等电聚焦（IEF）：各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被

5、聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。（图2.1）。图2.1 2DE原理示意图SDS-PAGE：SDS是阴离子变性剂，能将折叠的蛋白质分子打开并以一定的质量比（1.4:1）与蛋白质结合，这样所有的蛋白质都有相似的形状和荷质比，排除了蛋白质形状和所带电荷对电泳结果造成的影响，蛋白质分子迁移距离只跟蛋白质的分子量有关。在电场的影响下，带有SDS的负电荷的蛋白质向正极运动，分子量越大移动的越慢，反之，移动的越快。试剂和器材一、试剂IEF standard protein(BioRad 公司)，预制胶条pH 3-10（上海伯楷安生物科技有限公司），SDS-PAGE预制胶（上海伯楷

6、安生物科技有限公司），二硫苏糖醇（BioRad 公司），碘乙酰胺（BioRad 公司），尿素、tris碱（sigma）。实验过程中所用溶液配制参考附件文件。二、器材等电聚焦仪（上海伯楷安生物技术有限公司），水化槽（BioRad 公司），mini垂直板电泳装置（BioRad 公司）。图2.2等电聚焦仪图 2.3 SDS-PAGE装置操作方法等电聚焦操作：1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 3-10），室温平衡。2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品。3. 去除预制IPG胶条上的保护层。4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中。5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油，水化6-10小时。6. 将胶条从水化盘

7、中取出，去除矿物油后，将其放入等电聚焦盘内，对好正、负极，盖上盖子。7. 设置等电聚焦程序并运行。胶条平衡：8. 配制胶条平衡缓冲液 I 。9. 取出聚焦好的胶条，吸去胶条上的矿物油。10. 将胶条放入平衡盘进行第一次平衡。振荡15分钟。11. 配制胶条平衡缓冲液 II 。12. 进行第二次平衡 ，振荡15分钟。SDS-PAGE操作：13. 吸去预制胶玻璃板中液体。将玻璃板平放在桌面上。14. 琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。15. 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。16. 将放有胶条的SDS-PAG

8、E凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。17. 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。18. 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。19. 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。20. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流或低电压（5mA/胶条/7cm或者60V/胶条/7cm），待样品在完全走出IPG胶条（大约半小时），浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/胶条/7cm或者120V/胶条/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。21. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并

9、切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。考玛斯染色：22. 电泳后的凝胶立即浸泡在固定液（500 mL乙醇，100 mL冰醋酸，400 mL蒸馏水）中至少30 min。23. 将固定后的凝胶在染色液（0.29g考玛斯亮蓝溶解在250mL脱色液，最好加热60）中浸泡、震荡10 min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。24. 多次变换脱色液（250 mL乙醇，80 mL冰醋酸，用蒸馏水加至1000 mL），直至凝胶上背景脱净为止。为了加快脱色，可略加温度。25. 保存凝胶。注意事项（1） 全程操作都需要带橡胶手套，溶液的配制都需用超纯水II。（2） 胶条水化时，水化液与胶条之间不能存有气泡，聚焦步骤中同

10、样。（3） 平衡液中二硫苏糖醇和碘乙酰胺要现加。（4） 胶条转移过程中，SDS-PAGE电泳上部水分洗净后方可放入IPG胶条，并要求胶条与分离胶面紧密吻合，而且胶条的支持膜面贴靠一侧玻璃板。（5） 染色时间要严格控制。上海交通大学生化分析与分离实验室附件2：2DE试剂配制l 样品裂解液（8M尿素，4%CHAPS，2% 两性电解质 3-10）最终浓度用量尿素（Urea）8M*19.2gCHAPS4%（w/v）1.6g两性电解质 3-102%800 l双蒸水至40mlu 现配现用或以一定单位量在-20条件下储藏。u 若需要的话，尿素的浓度可以增至9或9.8 M。u 其它的去污剂（Triton X-

11、100、NP-40和其它非离子或兼性去污剂）能代替CHAPS。u 注意：若需要的话，可加入蛋白质水解酶抑制剂l 不含有IPG缓冲液的再水化储存液*（8M尿素，2%CHAPS，0.002%溴酚蓝）最终浓度用量尿素8M12gCHAPS2%（w/v）0.5g溴酚蓝0.002%（w/v）50 l双蒸水 至25mlu 在使用前加入DTT和IPG缓冲液或两性电解质溶液：每2.5ml单位的再水化储存液中加入7mgDTT。u 若需要的话，尿素的含量可以增加至9或9.8M。u 其它的去污剂（Triton X-100、NP-40和其它非离子或兼性去污剂）能替代CHAPS。u 2.5ml分装-20储存。l 溴酚蓝储

12、液最终浓度用量溴酚蓝1%（w/v）100 mgTris-base50 mM60 mg双蒸水 至25mll 含有IPG缓冲液的水化储存液*（8M尿素，2%CHAPS，0.5%或2%IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝，25ml）最终浓度用量尿素8ml/L12gCHAPS2%(W/V)0.5gIPG缓冲液或两性电解质溶液（与IPG胶条pH范围相同）0.5%（v/v）或2%(v/v)125或500l*溴酚蓝0.002%50 l 1%溶液双蒸水至25mlu 在使用前加DTT：每2.5ml单位的再水化储存液中加入7mgDTT。若通过水化液进行加样，在使用前，将样品加入到2.5ml单位的水化液中。u 若需要的

13、话，尿素的含量可以增加至9或9.8M。u 其他的去污剂（Triton X-100、NP-40和其它非离子或兼性去污剂）能替代CHAPS。u 125 l IPG缓冲液用于0.5%浓度，500 l IPG缓冲液用于2%浓度u 两性电解质溶液 3-10用于IPG 3-10 或3-10NL胶条，两性电解质溶液 5-8用于IPG 4-7胶条。u 2.5ml分装-20储存。l SDS平衡缓冲液*（50mM Tris-HCl，pH8.8，6M尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝，200ml）最终浓度用量1.5M Tris-HCl, pH 8.850mM6.7ml尿素6M72.07g蔗糖（87%v

14、/v）30%（v/v）69mlSDS2%（w/v）4.0g溴酚蓝0.002%400 l 1% 溶液双蒸水至200mlu 这是储存液，在使用前加入DTT或碘乙酰胺。u -20C 储存l 单体储液(30%丙烯酰胺，0.8% N, N-甲叉双丙烯酰胺，200ml)最终浓度用量丙烯酰胺30%60.0gN,N-甲叉双丙烯酰胺0.8%1.6g双蒸水重200mlu 用0.45m滤膜过滤溶液，4避光储存。l 4×分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCl pH8.8，1 L)最终浓度 用量Tris-base 1.5M 181.7g双蒸水750mlHCl 调至pH8.8双蒸水至1 Lu 用0.45m滤膜

15、过滤溶液，4存储。l 10%SDS最终浓度用量SDS10%(W/V)5.0g双蒸水至50mlu 用0.45m滤膜过滤溶液，室温储存。l 10%过硫酸铵最终浓度用量过硫酸铵10%0.1g双蒸水至1.0mlu 新鲜的过硫酸铵在加入水时发出劈啪声，声若没有，请更换过硫酸铵。在使用前配置。l 凝胶储存液（0.375MTris-HCl，pH8.8，0.1%SDS，200ml）最终浓度用量4×分离凝胶缓冲液1×50ml10%SDS0.1%2ml双蒸水至200mlu 4储存。l SDS电泳缓冲液（25mMTris-HCl，pH 8.3，192mM甘氨酸，0.1% SDS，10 L）最终浓

16、度用量Tris-碱25mM30.3g氨基酸192mM144.0gSDS0.1%10.0g双蒸水至10 Lu 由于这种溶液的pH值不用检测，这可以直接在10 L的试剂瓶中配制。u 在室温下储存。l 琼脂糖密封液最终浓度用量SDS电泳缓冲液100ml琼脂糖(NA 或M)0.5%0.5g溴酚蓝0.002%200 lu 将所有成分加入到500ml的烧瓶中。轻轻地摇晃，使成分混匀。在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解。不要让溶液爆沸。以2ml为单位分装，室温保存。l 凝胶蛋白银染试剂步骤试剂时间固定乙醇冰醋酸加蒸馏水至250ml200ml50ml2×60*min敏化乙醇戊二醛(25% w/v)硫代硫酸钠(5% w/v)醋酸钠（17g）加蒸馏水至250ml75 ml1.25 ml10 ml1包60min漂洗蒸馏水5×8min银染硝酸银溶液(2.5% w/v)甲醛（37% w/v）加蒸馏水至250ml25 ml0.1 ml60min漂洗蒸馏水4×1min显色碳酸钠（6.25g） 甲醛（37%）加蒸馏水至250ml1包 100 l5min¶终止EDTA-Na2×H2O(3.65g