培养系応用成熟脳细胞培养法开発

1、培養系応用成熟脳細胞培養法開発坂口卓也1,2,3、岡田竜美3,4、汐見理沙3,4、池井崇真3、宮本朋幸2,3,4、薬師寺宏匡2,3,4、大野節代2,3、三宅康之1,2,3、大野英治1,2,3,41加計学園細胞病理学、2倉敷芸術科学大学生命科学部生命科学科、3産業科学技術学部生命化学科、4大学院産業科学技術研究科機能物質化学専攻背景目的記憶司海馬、特徴的細胞構築持。 神経細胞 集合歯状回領域顆粒細胞層、CA3CA1至領域錐体細胞層形成。歯状回CA3、CA3CA1軸索投射興奮性形成。神経情報処理参与神経膠細胞 細胞 、共存。海馬細胞変性伴痴呆発症病研究、海馬培養標本多用。培養海馬標本胎生期脳分散細

2、胞用、源相当数動物脳必要、細胞未熟必成熟脳反映欠点。点改善為、予長期培養一旦成熟海馬細胞分散再培養新規培養系開発試。培養深麻酔下生後5日齢脳摘出、350m 厚海馬作成。下部培地満膜静置、培地/大気界面培養行。1996年版 “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23)” 準拠、全手術行。細胞分散再培養1-6週間培養海馬蛋白分解酵素処理後、細胞分散反応血清停止。細胞洗浄後、-L-施円形含 12 穴細胞蒔布培養開始。一部検討、海馬歯

3、状回領域切出培養。免疫細胞化学的解析標本0.1%-X処理、細胞膜透過性増大。細胞形質解析為、次抗体用免疫反応基解析行。 TuJ1：標識、突起中微小管構成蛋白 -Tubulin対抗体。 抗繊維酸性蛋白 GFAP 抗体：細胞一種、標識抗体。 RIP：細胞一種、標識抗体。結果1週間培養海馬分散細胞一旦全突起失、後再培養行突起伸展。2-6週間培養海馬分散細胞、一旦全突起失後数日間突起伸展伴著形態変化観察。後者標本細胞発現蛋白解析、TuJ1、抗GFAP抗体、RIP各陽性反応示細胞観察。、通常観察TuJ1抗GFAP抗体、TuJ1RIP両方陽性反応示細胞観察。考察数週間培養脳細胞分散再培養、源動物脳自体必要

4、成熟脳細胞培養系確立成功。TuJ1、抗GFAP抗体、RIP陽性反応示細胞各、相当海馬細胞示唆。TuJ1抗GFAP抗体TuJ1RIP両方陽性反応示細胞、既知細胞中間体示唆。技術成熟脳細胞研究、特損傷後脳再生機構解析為有用手段期待。参考資料坂口卓也、培養脳発芽起?生物物理206:176-180, 1996.坂口卓也、培養脳創薬研究応用33:614-616, 1997.坂口卓也、培養脳研究応用脳科学20:1345-1350, 1998胚性幹細胞由来胚様体細胞形態学的解析薬師寺宏匡2,3、宮本朋幸2,3、守本容子3、織田智博3、大野節代2、三宅康之1,2、坂口卓也1,2、大野英治1,2,31加計学園細

5、胞病理学、2倉敷芸術科学大学生命科学部生命科学科、3大学院産業科学技術研究科機能物質化学専攻背景目的幹細胞分化制御技術確立、再生医療鍵。細胞分化研究際、好適材料胚性幹細胞 ES細胞 。中ES細胞倫理的問題抵触、細胞多形分化能解析為多用。ES細胞培養進行個細胞分化多様性発現、細胞間相互関係変化起。一、胚様体呼細胞塊形成。細胞塊、ES細胞分化集合器官機能始示唆。近年、ES細胞分化機構関分子生物学的手法用研究盛行。分化誘導一端胚様体形成手法、形態解析詳細報告少。今回、胎生幹細胞形成胚様体対象形態学的解析行。胚様体形成機構解明為、発現蛋白解析試。、効果的分化誘導行為新規胚様体形成法検討。方法129SV

6、由来凍結胎生幹細胞解凍後、LIF含増殖培地中C処理済初代線維芽細胞用3日間培養、継代行。後処理細胞剥離、LIF抜分化誘導培地、微生物用、製、Hanging drop法用胚様体形成。培養皿中胚様体微分干渉顕微鏡観察、胚様体採取包埋切片作成、HE染色、免疫染色施検索。結果微生物用、製、Hanging drop法胚様体形成確認。形成胚様体拍動型非拍動型大別、連続切片cystic typenoncystic type2分。cystic type内腔一層円柱上皮様細胞被覆、noncystic type、心筋様細胞、腺管様細胞種細胞観察。胚様体相互融合面特異形態観察、E-cadherin発現確認。考察胚様体形成ES細胞培養皿底部付着、底部細胞反発性持必要。今回結果確認共、既知材質止新