凋亡调节因子与药物耐受性

1、凋亡调节因子与药物耐受性    肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床化疗失败的重要原因。本文综述细胞凋亡调节因子p53、bcl-2、bax等对肿瘤细胞耐药机制的影响和p53蛋白等对P一糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的调节作用，并介绍部分多耐药性新的研究进展。 放疗和化疗对肿瘤细胞有明显杀伤作用。然而成功治疗的一个重要障碍是肿瘤细胞对上述治疗无反应，并出现耐受细胞群，导致恶性肿瘤复发或浸润进展。因此了解细胞对化疗药物耐受基础成为许多实验研究的热点。一般而言，研究的重点是解释治疗因子怎样达到细胞内靶位点，并检查药物与靶位点相互作用的分子基础，如高水平表达MDRI基

2、因能够限制多种药物在细胞内的浓度，并引起多耐药性（MDR）。 最近几年里，探索和了解细胞凋亡机制，对肿瘤细胞获得或失去耐受细胞毒性机制有了新的认识。 1 凋亡调节因子对耐药性的调节作用 许多药物能诱导细胞凋亡，包括抗代谢药、脱氧核苷酸合成抑制剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、烷化剂及干扰微管药物等1。化疗药物引起凋亡的过程还不十分清楚，可能是药物打断了正常的细胞生长周期所致2。凋亡是一种可以被激活或抑制的可调节过程，因此可能还有在某些情况下药物耐受性的新解释。 1.1 p53 野生型p53（wt-p53）在细胞生长过程中以“分子警察”身份监视细胞内DNA状态，当DNA受损后，p53通过转录后稳定机制

3、抑制细胞停留在G1期，使细胞有时间修复，若修复失败，wt-p53将角发细胞凋亡。wt-p53缺乏或发生突变，将失去“分子警察”作用，不能诱导受损细胞凋亡，而使受损细胞得以生存。但由于细胞失G1期细胞周期检查点的DNA损伤监视作用，易造成诸如缺失、扩增和易位等染色体畸变。 Malcomson3采用温控p53表达载体转染鼠胚胎成纤维细胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32条件时，wt-p53表达，细胞滞留在G1期，明显表现出对药物介导凋亡的耐受性；而在37时，表达突变型p53，细胞在VP-16作用下，无明显生长抑制，继续增殖，并显示出剂量依赖性的细胞凋亡增多。提示wt-p53能介导细胞对VP

4、-16的耐受性。wt-p53介导的耐药性可能与药物作用特点有关。VP-16为细胞周期特异性药，主要作用于细胞周期的S期，干扰DNA的合成。一定剂量的VP-16作用细胞后，wt-p53使得细胞滞留在G1期而不继续增殖，因此，VP-16作用的靶位点减少，如同Topo酶含量下降介导的耐药性一样，引起细胞对VP-16的耐药性。Wosikowski4检测13例对阿霉素（ADM）、长春花碱、顺铂（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐药的乳腺癌细胞株，仅1例发生p53基因突变。 但许多学者认为低浓度化疗药物可引起表达wt-p53的细胞凋亡，在缺乏wt-妇生基因突变后，须大剂量药物方能引起细胞死亡5、wt-p

5、53的缺失或突变间接导致了药物耐受性。Lowe6通过体内实验发现，表达Wt-p53基因的肿瘤细胞在经放射性和ADM治疗后，绝大多数细胞发生凋亡；相反，相同因子治疗p53基因缺陷的肿瘤细胞MEFS，对放疗和几种化疗药物有较强的耐药性。但将wt-p53基因转染到MEFS细胞，低剂量放疗，或小剂量的ADM、VP-16等药物处理后细胞迅速凋亡。另有报道wt-p53能促进体外培养的人粘液表皮样癌细胞凋亡。 p53对细胞耐药性的调节可能是双向的，具体作用方式可能与细胞种类、状态及药物作用特点和剂量有关。如突变型p53可能更多引起细胞对细胞周期非特异性药物耐受，而wt-p53介导细胞对某些细胞周期异性药物耐

6、受。 1.2 Bcl-2家族 一些研究发现bcl-2基因家族蛋白表达水平变化，能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的阻抗。Dole7用bcl-2表达载体转染人类神经母细胞瘤细胞株Shep-1，发现高表达bcl-2克隆的细胞株对CDDP和VP-16引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗。Miyashita1采用基因转染方法，发现bcl-2能使细胞增加对地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、长春新碱（VCR）、VP-16和CDDP等药物耐受性。与对照组细胞相比， bcl-2蛋白并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但在维持细胞存活中起着重要调节作用。在VP-16和CDDP等化疗药物去除后，bcl-2蛋白能够重新

7、启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。 Pantazis8研究VCR诱导人白血病细胞株U-937/WT形成VCR耐药细胞亚株U-937/RV，在U-937/WT细胞中不能检出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表达，而在U-9377/RV均可检出；但在U-937/RV中亦可检出bax蛋白表达，后者是一种凋亡启动因子，是一种bcl-2蛋白的异源二聚体，可抵销bcl-2的活性作用，而在敏感株中未检出bax蛋白。由此可见bcl-2家族在细胞耐药过程中的作用也是相互调节和相互制约的。 1.3 p53与bcl-2家庭间的相互影响 细胞凋亡是一个多因子参加的复杂的生理过程，药物影响能诱发p53和bcl-2等蛋白

8、发生一系列变化，参与细胞的耐药性。 Miyashi9研究发现wt-p53能与bcl-2基因上p53依赖性的负反应元件结合抑制bcl-2的表达。Eliopoulos10检测p53和bcl-2蛋白在敏感和耐药的卵巢癌细胞株中表达水平，结果显示耐药株过度表达p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用环节可能在p53之上。许多临床资料亦发现突变型p53和bcl-2蛋白的高表达与不良预后有关。 Ju11将wt-p53传染wt-p53阴性的HL-60细胞形成转染株SN3，与母代细胞相比，对化疗药物的敏感性明显增加，如对CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分别增加2倍和50倍；而用突变型p53传染的细

9、胞无比现象。用胸苷合成酶抑制剂FdUrd观察与p53相关联基因表达变化，在各种浓度的FdUrd存在下，很大比例的SN3细胞发生凋亡，而不是停留在S期。母代细胞有不确定的bax水平和高水平的bcl-2表达。在SN3细胞bcl-2检测不出，并维持适当基础水平的bax。FdUrd治疗后，wt-p53和bax水平增加，但bax诱导早于p53，且平行出现细胞凋亡的DNA条带。Perego12检测p53与顺铂导致耐药性间的关系时，发现在卵巢癌药细胞株中，突变型p53失去激活bax基因转录能力。 这些资料说明p53、bax-2和bax等凋亡调节因子在肿瘤细胞的耐药机制中起重要作用，但作用方式是复杂多样的。

10、2 p53对耐药蛋白的调节作用 p53具有不同结构区域。wt-p53与DNA共有区结合后，能正向调节一系列下游基因的表达。另外，wt-姢负向调节许多缺乏wt-p53共有区结合位点基因，包括DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和细胞的启动子。 2.1 p53对多药耐药相关蛋白（MRP）表达的调节 转录因子spl是MRP基因启动子的强激动剂，wt-姢与spl结合，消除spl作用，从转录水平调节MRP表达。Wang13将带有虫荧光素酶标记报告基因的MRP启动子与wt-p53共同转染p53阴性的人类非小细胞肺癌细胞株H1299和鼠（10）1细胞，结果显示wt-p53能呈剂量依赖性地显著抑制MRP启动子活性，wt-忍气吞声作用位点为-91到+103bp，该处有数个spl结合位点；而突为型p53只有很弱的作用。同时研究还发现wt-p53还能抑制高表达MRP的CEM/VM-1-5细胞的内源性MRP表达。Oshika14采用免疫组化技术检测107例非小细胞肺癌标本，MRP和突变型p53表达有明显相关性，双染色技术显示p53和MRP在一些细胞上同时表达，这些病人预后明显罗无MRP和突变型p53患者差。 2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表达的调节 P-gp是有MDR1基因编码的多药耐药蛋白。wt-作用